核酸的理化性质

第三节核酸的理化性质
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一、核酸的分子大小
一核酸的分子大小
二、核酸的溶解度与粘度
微溶于水，不溶于有机溶剂，常用乙醇来沉淀DNA ；
DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于1-2 mol/L的NaCl溶液，RNA则相反，可据此分离二者。

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三、核酸的酸碱性质
核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质。

p
对DNA来说，碱基对在pH4.0～11.0最稳定。

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四、核酸的紫外吸收
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OD
260的应用
1.判断核酸样品的纯度
–DNA纯品: OD 260/OD 280= 1.8纯–RNA纯品: OD
260/OD 280= 2.0–含杂蛋白及苯酚，降低 2. DNA或RNA的定量
对于纯样相当于对于纯样品，OD 260=1.0相当于
•50μg/ml双链DNA
•40μg/ml单链DNA（或RNA）
•20μg/ml寡核苷酸
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核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。

摩尔吸光系数30.98A
ε）＝
ε：摩尔吸光系数A：吸收值
P WL
（）W：每升溶液磷重量L：比色杯内径
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3.判断DNA是否变性
核酸在变性时，紫外吸收增
加的现象称为增色效应；
在一定条件下，变性核酸可
以复性，紫外吸收又恢复到
原来水平，这一现象称为减
原来水平这现象称为减
色效应。

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五、核酸的变性、复性和杂交
五核酸的变性复性和杂交
（一）变性P260
定义：核酸受到加热、极端的pH或离子强度的定义核酸受到加热极端的H
降低等因素或特殊的化学试剂作用，其
双螺旋区的氢键断裂变成单链的过程。

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变性后其它理化性质变化：
OD260增高粘度下降
比旋度下降浮力密度升高
酸碱滴定曲线改变生物活性丧失
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DNA的紫外吸收光谱
¾增色效应：当核酸变性时260nm处光吸收值显著增加的现象。

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¾热变性：DNA的稀盐溶液加热到80~100℃，热变性的稀盐溶液热℃几分钟后双螺旋结构被破坏，氢键断裂，两条链彼此分开形成无规则线团的现象。

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¾解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。

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¾Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这范围内的螺旋有半发生热变在这一范围内，DNA的双螺旋有一半发生热变性时相应的温度称为“熔点”(melting
temperature,Tm)。

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1DNA均性影响T m 的因素：
1. DNA均一性均质变性温度范围小，异质DNA 变性温度范围大
变性温度范围大。

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2G C含量2. G-C含量
经验公式：GC%=(T m -69.3)×2.44
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3离子强度3. 离子强度
离子强度低的介质T 较低熔解温度范围较宽
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离子强度低的介质，T m 较低，熔解温度范围较宽
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（二）复性和杂交
1、复性
DNA复性(renaturation)的定义
当变性因素不复存在时，变性N的两条单
当变性因素不复存在时，变性DNA的两条单链可部分或全部恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。

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后即复性这热变性的DNA 经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为(annealing) 。

过程称为退火(g)20
Kary B. Mullis 1985年发明了聚合酶链反应
（PCR ）技术
1993年获诺贝
尔化学奖
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影响复性的因素：
★温度
★DNA浓度
★离子强度
★DNA序列的复杂度
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2、核酸杂交
2核酸杂交
相同或不同来源的2个DNA分子，或DNA与RNA分子，如果含有彼此互补的序列，混合在一分，彼序列，合起，通过变性和复性处理，形成DNA-DNA或DN A-RNA杂交体，称为核酸的分子杂交。

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完全变性的
完全变性的样品1DNA
样品2DNA
混合并冷却
样品1 双螺旋
杂化双螺旋25
样品2 双螺旋
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Southern blotting g DNA分子之间的杂交
Northern blotting Northern blotting RNA分子之间的杂交
Western blotting
蛋白之间的相互作用28
六、核酸的水解
六核酸的水解
酸水解
1.酸水解
糖苷键比磷
酸酯键更易水解，
特别是嘌呤与脱
氧核糖之间的糖
苷键很容易水解。

苷键很容易水解
碱水解
2.碱水解
通常用于RNA
水解，DNA的碱
水解比较困难
水解比较困难。

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3.酶水解
核酸酶是指所有可以水解核酸的酶
依据底物分类
¾依据底物不同分类
酶(y,)
DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)
RNA酶(ribonuclease, RNase)
¾依据切割部位不同分类
核酸内切酶：限制性核酸内切酶
核酸外切酶
依据磷酸二酯键断裂方式不同分类
5´核苷酸，3´核苷酸
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限制性内切酶识别特殊的DNA序列
酶切位点
酶切位点对称轴
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七核酶的催化性质七、核酶的催化性质
催化性RNA (ribozyme)
•序列特异性的核酸内切酶
•参与RNA转录后加工修饰
•作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解
mRNA。

催化性DNA (DNAzyme) 催化性(y )人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。

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核酸的合成分离纯化及含量测定
第四节核酸的合成、分离纯化及含量测定
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一、核酸的化学合成
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每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(2) 缩合：新生成的5′-OH在
四唑催化下与下一个核苷3′-
磷酰亚胺单体缩合使链增长。

(1) 脱三苯甲基：
末端核苷酸的DMTr
用三氯乙酸/二氯甲
烷溶液脱去，游离
烷溶液脱去游离
出5′-OH。

(3) 盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的
5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化
′
下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合
造成错误延伸。

(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化
(4)氧酸中的价氧
成五价磷。

上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸
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一个核苷酸。

核酸的分离纯化和定量
注意事项二、核酸的分离、纯化和定量注意事项：
1低温（0º～4℃）1．低温（0～4℃）2.防止过酸、过碱3避免剧烈搅拌振摇3.避免剧烈搅拌振摇4.防止核酸酶的作用
Dnase抑制剂：柠檬酸钠—螯合Mg 2+
Rnase抑制剂：皂土吸附Rnase Rnase抑制剂：皂土—吸附Rnase
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（）核酸的提取
（一）核酸的提取
1.两种核蛋白的分离：
用1mol/L NaCl溶液提取脱氧核蛋白；用0.14mol/L NaCl溶液提取核糖核蛋白。

2.蛋白质的去除：
用蛋白质酶消化和酚/氯仿多次抽提。

用蛋白质酶K消化和酚/氯仿多次抽提。

3.核酸的沉淀：
3核酸的沉淀：
用2.5-3倍体积冷无水乙醇沉淀。

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（二）电泳
制胶
电泳
显色
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（三）离心
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（四）色谱
（五）核酸含量测定的原理
1.定磷法
RNA=9.4%
DNA=99%
DNA=9.9%
浓硫酸水解核酸的磷酸，酸性条件下磷酸与钼酸形成磷钼酸，用还原剂还原磷钼酸，660nm 钼酸形成磷钼酸用还原剂还原磷钼酸660nm 比色测定含量
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2.定糖法
(1)苔黑酚法（地衣酚法）--RNA
(2)二苯胺法--DNA
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3、紫外吸收法
紫外收法
DNA或RNA的定量
OD 260=1.0相当于
O10相当
μg链
50g/ml双链DNA
35μg/ml单链DNA
40μg/ml的RNA
判断核酸样品的纯度
DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8
RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
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常用二苯胺法测定含量，用苔黑酚法测定含量。

常用苯胺法测定含量用苔黑酚法测定含量引起核酸变性的因素很多，例如、、。

引起核酸变性的因素很多例如
判断
mRNA是细胞内种类最多、含量最丰富的蛋白质。

tRNA的二级结构中额外环是tRNA分类的重要指标。

RNA的级结构中额外环是RNA分类的重要指标
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双链DNA热变性后（）
A黏度下降B沉降系数下降C浮力密度下降D紫外吸收下降E以上都不对
比较RNA和DNA的组成,下列哪项是正确的（）
A.核糖相同,部分碱基不同
B.碱基相同,核糖不同
A核糖相同部分碱基不同B碱基相同核糖不同
C.DNA中含有U,RNA中含有T
D.DNA中含核糖,RNA中含脱氧核糖
E.部分碱基相同,核糖不同
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1核酸的组成？
1、核酸的组成？
2、什么是DNA的一级结构？DNA一级结构的特征？
3、DNA双螺旋结构模型的主要特征是什么？DNA 3DNA双螺旋结构模型的主要特征是什么？DNA 双螺旋结构的稳定因素是什么？
4、原核生物和真核生物mRNA的结构特征？
4原核生物和真核生物mRNA的结构特征？
5、简述tRNA二级结构的基本特征。

6、核酸的紫外吸收特性。

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什么是核酸的变性与复性
7、什么是核酸的变性与复性？
8、什么是Tm？影响Tm的因素有哪些？
9什么是增色效应减色效应？
9、什么是增色效应、减色效应？
10、碱基互补配对原则
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