Nrf2-Keap1抗氧化系统与肝脏疾病

研究生课程论文（作业）封面（2014 至2015 学年度第1 学期）
课程名称：兽医内科学专题
课程编号：206332
学生姓名：
学号：
年级：2014级
任课教师:
提交日期：2014年11月25日
成绩：__________________
教师签字：__________________
开课---结课：第 1 周---第18 周
评阅日期：年月日
东北农业大学研究生部制
Nrf2-Keap1抗氧化系统与肝脏疾病
（东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨150030）
摘要
氧化应激与肝脏疾病关系密切。

Nrf2-Keap1是细胞抵御氧化应激的一个重要调控系统，可诱导抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表达，清除活性氧族，减轻细胞凋亡，本文对Nrf2-Keap1抗氧化系统进行概述，探讨其与肝脏疾病的联系。

关键词：Nrf2-Keap1；氧化应激；肝脏
Nrf2-Keap1 Antioxidant System and Liver Disease （College of veterinanry Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）
Abstract
Oxidative stress and liver disease are closely related. Nrf2-Keap1 is an important regulatory system cells against oxidative stress, and can induce the expression of phaseⅡdetoxifying enzymes, scavenging reactive oxygen species, reducing apoptosis, This article mainly reviewed Nrf2-Keap1 antioxidant system, discussing its links with liver disease.
Key words: Nrf2-Keap1; oxidative stress; liver
引言
Nrf2是一个由氧化应激介导的转录因子，伴随一系列下游目的基因以保护细胞。

有研究表明Nrf2-Keap1抗氧化系统能增加肝脏抵抗氧化应激的能力[1]。

1 Nrf2的概述
Nrf2首次从人类白血病细胞系（K562）的互补DNA文库中克隆出来，属于帽和领（Cap'n'Collar，CNC）转录因子家族成员，是一个由2.2kb的碱基对编码的相对分子质量为66000的蛋白质。

Nrf2基因区域含有6个功能区，分别被命名为Nehl-6，Keap1是其特异性受体，正常情况下Nrf2作用被Keapl抑制，在氧化应激等情况下与Keapl解离被激活，Nehl 区中有一个亮氨酸拉链结构bZIP，bZIP与小Maf蛋白（small Mafproteins，包括MafG、MafK、MafF）形成异二聚体，识别抗氧化反应元件（ARE）上DNA基序（GCTGAGTCA）并与之结合，启动ARE调控的第Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表达，增加细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性[2-6]。

2 Keap1的概述
Keap1即Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1，也被称作INrf2。

Keapl最初描述在胞质中锚定于肌动蛋白，对Nrf2起着重要的负调节作用。

在生理状态下，Nrf2的N末端上Neh2结构与Keap1的C末端上Kelch重复区域结合，铆合在肌动蛋白细胞骨架上。

Keap1有三个主要的区，N末端BTB区、一个连接片段（IVR）以及C末端肌动蛋白结合区（DGR）。

Keap1的N末端，与其他BTB家族蛋白相似，是Cullin依赖性E3泛素连接酶的作用底物，可致使Nrf2泛素化并最终被Cullin依赖性E3泛素连接酶降解，所以BTB域是Cul3/Rbx1诱导Nrf2降解时的中间接合物[7]。

Keap1的C末端DGR区，对铆定Nrf2起重要作用[8]。

3 Nrf2与Keap1的相互作用
Keap1在哺乳动物细胞中以同源二聚体形式存在，并以这种形式与一个单分子Nrf2结合。

对于Nrf2与Keap1的结合，近来的研究提出了一个“铰链与门闩（hinge and latch）”的相互作用理论。

实验研究发现，Nrf2上Neh2域中存在2个不同的Keap1结合位点，即保守的29DLG31和79ETGE83基序，其可与Keap1上DGR域中一个独立重叠的部位紧密结合，从而保证泛素的有效转移和Nrf2被蛋白酶体降解；在正常情况下，Keap1与高亲和力的ETGE 基序结合后，可使Nrf2相对自由地移动，类似于“铰链”，而同时与低亲和力的DLG域结合后，严格限制了Nrf2使其靶赖氨酸处于与泛素结合的最佳位置，类似于“门闩”；而在化学/
氧化应激条件下，由于Keap1失去与DLG的“门闩”式结合，导致Nrf2泛素化受阻，且同时因Nrf2上靶赖氨酸的位置出现偏差，Nrf2不再能被蛋白酶体降解，但可能由于ETGE的“铰链”式连接仍存在，致使Keap1与Nrf2的结合处于饱和状态，任何新合成的Nrf2得以在细胞核蓄积，并激活细胞保护性基因，从而对细胞应激起解毒作用。

3.1 Keap1上的氨基酸残基
大量研究数据表明，Keap1上某些确定的半胱氨酸残基可能是诱导Nrf2和细胞保护性酶等亲电子化合物的靶标。

靶标定点突变实验显示，Keap1上Cys-151、-273和-288对Keap1功能发挥起至关重要的作用，这些半胱氨酸残基也可能就是Nrf2等亲电子诱导剂的靶标，其中，Cys-151位于Keap1的BTB域，在化学或氧化应激条件下，可使Nrf2的抑制和泛素化减少，是诱导Nrf2从Keap1中释放的关键靶位，而Cys-273和-288处于Keap1上半胱氨酸丰富的插入区（IVR），在生理条件下其抑制Keap1活性的作用十分必要，在Keap1上Cys-273和-288发生突变的细胞中，Nrf2活化分子的反应性降低或消除[9]。

此外，新近的研究发现，Keap1上还有其他靶位的作用也可将Nrf2从抑制中解除而激活。

例如，Keap1对Nrf2的抑制作用还依赖于其是否能形成二聚体，Keap1上104位保守的丝氨酸残基（Ser-104）在二聚化过程中起重要作用，其突变将导致Keap1二聚体的解离和Nrf2的释放；而Keap1上141位酪氨酸（Tyr-141）的磷酸化和脱磷酸化也能调节Keap1的稳定性和降解，Tyr-141的磷酸化是Keap1维持稳定所必需的，Tyr-141的脱磷酸化则会导致Nrf2的释放。

3.2 Nrf2的磷酸化
半胱氨酸残基的存在是Nrf2活化分子的一个共同特征，而磷酸化信号传导通路的激活也可能刺激Nrf2依赖性细胞防御，如可促进蛋白高度磷酸化的蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸在HepG2细胞中能刺激Nrf2的核蓄积和ARE受体转基因的激活[10]。

许多研究显示，作为对Nrf2功能的一个调节性影响，磷酸化过程可通过药理上抑制特异性蛋白激酶而起作用，这将减弱Nrf2被已知的活性分子的诱导；抑制一条蛋白激酶通路确实对多种细胞信号传导过程有显著影响，并可能影响Nrf2信号传导通路的完整性[11]。

而另有研究显示，蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、PKR样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等的磷酸化作用会促进Nrf2和Keap1的解离[12]。

目前，研究得比较透彻的是，PKC致使Nrf2上Neh2域的Ser-40磷酸化，能导致Nrf2与Keap1的解离；Nrf2的翻译后修饰也会诱导激活ARE[13]。

但最近有实验研究表明，酪氨
酸激酶Fyn致使Nrf2上Tyr-568磷酸化后，可使Nrf2从核中移出[14]。

因此，Nrf2的磷酸化过程可能是其激活和失活的一个重要信号传导事件，可分别促进Nrf2的核蓄积和从细胞核中移出。

4 Nrf2-Keap1在肝损伤和肝病中的作用
肝脏是机体的主要代谢器官。

作为代谢的第一站，肝脏通常暴露在较高浓度的外源物和其他化学物质下，因此肝脏具备一系列抗氧化机制，能够清除自由基，维持体内自由基的代谢平衡。

尽管如此，但是由于肝脏所处的位置与功能，它仍易受到中间活性物质引起的氧化损伤。

氧化应激主要通过启动膜脂质过氧化来改变生物膜功能、与生物大分子共价结合及破坏机体内酶的活性等，在细胞因子（如TNF-α，NF-κB）的共同作用下引起不同程度的肝损伤[15-16]，这是动物健康的一个巨大困境。

Nrf2-Keap1抗氧化系统，调控抗氧化酶基因的转录活性，包括醌氧化还原酶（NADPH），谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCLC and GCLM）、谷胱甘肽（GSH）等。

这些酶能够保护肝脏免受中间活性物质引起的氧化损伤[17-19]。

所以Nrf2-Keap1抗氧化系统涉及肝脏的各个领域，如调节肝脏的代谢、解毒及促进肝细胞再生，在肝损伤、脂肪肝、肝纤维化及肝癌等方面也具有保护作用。

在肝脏代谢方面，运载体是肝脏对药物和环境化学毒物解毒的完整组件，Nrf2可调控运载体的表达，肝脏的Nrf2-Keap1抗氧化系统通过Ⅱ相解毒酶和运载体调节代谢和转运过程来参与药物、胆固醇、糖的代谢及解毒。

如Nrf2缺失小鼠使扑热息痛的葡萄糖酸化降低，导致N-乙酰-对-苯醌亚胺（NAPQ1）和肝毒性的增加，激活的Nrf2通过Nqo1及经由运载体多药耐药相关蛋白3（Mrp3）增加对扑热息痛葡萄糖苷酸化代谢产物的排除来促进NAPQ1的解毒[20]。

Nrf2缺失小鼠能抵制胆结石的形成，Nrf2在肝脏对胆固醇的摄取、代谢及排泄方面有一定的影响[21-22]。

在链唑霉素诱导的小鼠1型糖尿病中，Nrf2缺陷小鼠肝脏糖异生葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸丙酮酸羧基激酶的mRNA增加并且糖酵解丙酮酸激酶的mRNA减少，所以导致小鼠高血糖和尿排出量增加。

楤木属根的乙醇抽提物对叔丁基-过氧化氢（t-BHP）所致的肝毒性的保护作用是经由Nrf2信号途径的抗氧化酶HO-1。

Nrf2是肝癌的重要调节剂，Nrf2调整的抗氧化酶及解毒酶的基因多态性与肝癌的发生密切相关。

HBV的慢性感染和饮食中摄入黄曲霉素可增加肝细胞癌的发生率，虽然乙型肝炎疫苗及减少食物储存过程中被黄曲霉素污染的措施已广泛采用，然而完全排除黄曲霉素污染是不可能的。

所以用化学预防措施对黄曲霉素进行生理处理来降低肝细胞癌的发生率很关键。

在上海，科学家正在研究饮用红茶以激活Nrf2的活性来预防黄曲霉素-B1诱导的肝癌。

对啮齿类动物及临床研究发现：Nrf2-Keap1-ARE信号诱导物能增加细胞保护酶的表达，能有效地调节体内黄曲霉素的处理，有效地降低肝细胞癌的发生。

5 结论
Nrf2-Keap1系统是抵抗各种环境应激和内源性应激防御机制中必不可少的部分，被认为是最重要的抗氧化系统，受到越来越多的关注。

Nrf2-Keap1系统对于动物肝脏疾病的预防和治疗是一个重要的目标，有望为动物肝脏疾病的防治提供新的思路。

参考文献
［1］Zhao L, Guo JS, Guo ML. The study of alkaline ionized water improving heat tolerance and antioxidant ability in mice[C]. 2nd Acad Conf PaP Shanghai J Prevent Med, 2006, 284-286
［2］Niess AM, Dickhuth HH, Northoff H. Free radicals and oxidative stress in exercise- immunological aspects[J]. Exerc Immunol Rev, 1999, 5: 22-56
［3］Wells PG, Kim PM, Laposa RR. Oxidative damage in chemical teratogenesis[J]. Mutat Res, 1997, 396(1-2): 65-78
［4］Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function[J]. Physiol Rev, 2002, 82(1): 47-95
［5］Gutteridge JM, Halliwell B. Comments on review of Free Radicals in Biology and Medicine, second edition, by Barry Halliwell and John M. C. Gutteridge[J]. Free Radic Biol Med, 1992, 12(1): 93-95
［6］Yu J, Liu F, Yin P, et al. Integrating miRNA and mRNA expression profiles in response to heat stress-induced injury in rat small intestine[J]. Funct Integr Genomics,2011, 11(2): 203-213
［7］Zou X, Feng Z, Li Y. Stimulation of GSH synthesis to prevent oxidative stress-induced apoptosis by hydroxytyrosol in human retinal pigment epithelial cells: activation of Nrf2 and JNK-P62 /SQSTM1 pathway[J]. J Nutr Biochem, 2012, 23(8): 994-10061
［8］刘芳, 杜志银, 王应雄. Keap1 在氧化应激方面的研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2010, 15(5): 596-600
［9］Yang M, Yao Y, Eades G. MiR-28 regulates Nrf2 expression through a Keap1 independent mechanism[J]. Brest Caner Res Treat, 2011, 129(3): 983-991
［10］Luo Y, Eggler AL, Liu D. Sites of alkylation of human Keap1 by natural chemoprevention agents[J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2007, 18: 2226 -2232
［11］宋亚昕. 转录因子NF-E2相关因子2-抗氧化转录元件信号转导路径细胞保护作用的研究进展[J]. 医学研究生学报, 2009, 22(4): 431-437
［12］Hayes JD, McMahon M. NRF2 and KEAP1 mutations permanent activation of an adaptive response in cancer[J]. Trends Biochem Sci, 2009, 34 (4): 176-188
［13］Li H, Ren YZ, Duan HJ. Effects of tBHQ on the oxidative stress and the expression of Nrf2 in kidney of diabetic mice[J]. Chin Pharmacol Bull, 2009, 25(2): 1341-1344
［14］Nguyen T, Yang CS, Pickett CB. The pathway and molecularmechanisms regulating Nrf2 activation in response to chemical stress[J]. Free Radic Biol Med, 2004, 37(4): 433-441［15］Maruichi T, Fukami T, Nakajima M. Transcriptional regulation of human carboxylesterase by Nrf2[J]. Biochem Pharmacol, 2010, 79(2): 288-295
［16］Niture SK, Kaspar JW, Shen J, Jaiswal AK. Nrf2 signaling and cell survival[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2010, 244(1): 37-42
［17］Eades G, Yang M, Yao Y. MiR-200aregulates Nrf2 activation by targeting Keap1 mRNA in breast cancer cells[J]. Biol Chem, 2011, 286(47): 40725-40733
［18］李煌元, 石年. Keap1-Nrf2/ARE通路在分子毒理学中的研究进展[J]. 国外医学:卫生学分册, 2006, 33(3): 129-135
［19］宁章勇, 刘思当, 赵德明. 热应激对肉仔鸡呼吸, 消化和内分泌器官的形态和超微结构的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2003, 34(6): 558-561
［20］Kwak MK, Wakabayashi N, Kensler TW. Chemoprevention through the Keap1-Nrf2 signaling pathway by phase enzyme inducers[J]. Mut Res, 2004, 555(1-2): 133-148［21］Enomoto A, Itoh K, Nagayoshi E. High sensitivity of Nrf2 knock out mice to acetaminophen hepatotoxicity associated with decreased expression of ARE-regulated drug metabolizing enzymes and antioxidant genes[J]. Toxicol Sci, 2001,59(1): 169-177
［22］Chan K, Han XD, Kan YW. An important function of Nrf2 in combating oxidative stress: detoxification of acetaminophen[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(8): 4611-4616。