豆粕中抗营养因子检测技术研究进展

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粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 1 期
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1． 5 高 效 阴 离 子 交 换 色 谱—脉 冲 安 培 检 测 （ HPAEC － PAD）
离子交换色谱—脉冲安培法是检测蔗糖、水苏 糖和棉籽糖含量较为灵敏的一种方法。糖类带有阴 离子要使用强碱性的流动相，检测时用金电极作为 工作电极。用阴离子交换色谱柱，150 mmol NaOH 为流动相，采用等梯度洗脱。所有的三糖在保留时 间为 16 min。这种方法不仅有很高的选择性，而且 比示差折光检测器的灵敏度高［19］。
Luoyang Henan 471003； 2． Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037）
Abstract： Soybean meal has been widely used as a good protein resource in monogastric animal feed for its characteristics of high protein content and balanced nutrients． However，the application of soybean meal was limited since it contained some anti － nutritional factors，such as soybean antigen proteins（ sensitizing factor） ，oligosaccharide，phytic acid and goitrogen etc． The progress and application effect of the methods that can be used to detect the anti － nutritional factors in soybean meal were introduced． The shortages were summarized and the speculations regarding future directions of these methods were analyzed． Key words： soybean meal； soybean oligosaccharides； phytic acid； antigen protein； detection technology
本文综述国内外大豆中热不敏性抗营养因子检 测方法的研究进展，以期为低抗营养因子豆粕加工 方法的建立和评价提供指导。
1 大豆低聚糖的检测
大豆中可溶性糖类主要由蔗糖、棉籽糖以及水 苏糖组成，这 3 种糖类分别占大豆干基含量的 5% 、 1% 和 4%［7］。其中，水苏糖和棉籽糖属半乳糖苷类 非还原性功能低聚糖，与营养性糖类相比，水苏糖和 棉籽糖虽然不能为机体提供营养，但其对肠道益生
薄层色谱法是以薄层吸附剂为固定相，溶剂为 流动相的一种分离技术。廖春龙等人运用薄层层析 技术分离单糖与低聚糖，展开剂为乙腈∶ 冰乙酸∶ 水 = 6 ∶ 3 ∶ 2，显色剂为苯胺 － 二苯胺 － 磷酸，点 样 5 μL，层析显色后，苯酚 － 硫酸法比色测定。结果显 示薄层层析可将棉籽糖和水苏糖分开，线性范围为 20～ 80 mg / mL（ Ｒ2 = 0． 993 2） ，精密度为 1． 56% ，加 样回收率为 98． 14% ，相对误差为 3． 22% ，故可用于 大豆低聚糖的检测［17］。与气相色谱、高效液相色谱 相比，薄层层析法所需样品量大，误差大，不适合准 确定量分析，但其具有快速、简单、低成本等优点，也 不失为单糖、低聚糖的一种半定量检测方法。 1． 4 气相色谱法（ GC）
气相色谱检测具有高效、快速、高灵敏度以及样 品用量小的优点。因为气相色谱用惰性气体做流动 相，被分析样品必须具有一定的蒸汽压，一般对样品 的要求是在 190～ 500 ℃ 范围内有 0． 2～ 10 mmHg 蒸 汽压。薛连海以二甲基亚砜和环己烷为溶剂，衍生 化 － 萃取法处理低聚糖样品，克服了吡啶为溶剂方 法的缺点。测得棉籽糖和水苏糖的回收率为98． 5% 和 98． 2% ，相对偏差为 2． 9% 和 3． 9% 。 ［18］
酶解法是先采用 α － 半乳糖苷酶和转化酶将大 豆中棉籽糖分解为半乳糖、葡萄糖和果糖，然后使用 葡萄糖氧化酶和过氧化物酶试剂检测葡萄糖含量， 间接检测出样品中低聚糖含量。由于水苏糖和棉籽 糖的分解产物相同，因此，这种方法不适合样品中水 苏糖和棉籽糖单独检测。同时样品中存在的游离蔗 糖和葡萄糖会对结果产生影响。尽管这种方法有局 限性，但由于其方便快捷而一直被广泛使用。 1． 3 薄层色谱法（ TLC）
由于植酸酶是一种蛋白质它的空间结构极易受到外界的影响当所处环境碱性过高时其活性中心容易受到破环因此需要使用浓盐酸或冰醋酸控制ph值来保持酶的活性28反向高效液相色谱法反向高效液相色谱法是用hcl提取植酸然后用反向c18色谱柱进行分离以醋酸钠或磷酸二氢钾为流动相使ip6从多种醇中分离出来然后进行定量29
Progress in detection technology of anti － nutritional factors in soybean meal
FU Ting － ting1 ，LI Ai － ke1，2 ，LIANG Xin － xiao2 ，YUN Ting － ting2 ，WANG Yong － wei2 ，QI Wen － tao2 （ 1． College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，
收稿日期： 2013 － 06 － 07 基金项目： 新型优质蛋白饲料原料生产关键技术研究（ 2011 BAD26
B01 － 3） 作者简介： 付亭亭，1987 年出生，女，硕士研究生． 通讯作者： 綦文涛，1977 年出生，男，博士，副研究员．
热点。 豆粕中的抗营养因子分为热敏性和热不敏性两
大类［4］。热敏性抗营养因子主要有： 胰蛋白酶抑制 因子、脲酶以及大豆凝集素等［5］。这些抗营养因子 已经证明可以通过加热，或者在加工过程中将其除 去，而不影响豆粕的使用价值。热不敏性抗营养因 子主要有： 抗原蛋白、植酸以及水苏糖等低聚糖类。 这些抗营养因子很难将其除去，因而成为了评价豆 粕质量优劣的重要指标［6］。
但是由于糖类的挥发性差，检测之前需要预先 将其制备成易挥发且对热稳定的衍生物。气相色谱 进样口的高温会将糖类的衍生物部分分解，进样口 的残留物甚至会把衍生物催化。因此使用受到了局 限。除了这些局限以外，气相检测的流动相也限制 了该方法的应用。以往的气相色谱法是以吡啶为溶 剂的衍生化方法，吡啶毒性较大，对检测人员的身体 健康不利，吡啶极性较大会使溶剂峰拖尾造成定量 不准确，而且要求在无水条件下操作，样品在吡啶中 难溶解使操作繁琐。
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菌双歧杆 菌 和 乳 杆 菌 有 特 异 性 的 增 殖 作 用［8］。 然 而，水苏糖 和 棉 籽 糖 也 存 在 一 些 难 以 解 决 的 问 题。 首先，它们是一种 α － 半乳糖苷类低聚糖，人和动物 体内缺乏 α － 半乳糖苷酶，不能将其水解而消化利 用，因此提 供 能 量 较 低［9］。 更 为 严 重 的 是，由 于 水 苏糖和棉籽糖的难消化性而导致了单胃动物，尤其 是幼龄动 物 的 胃 肠 胀 气、腹 痛、腹 泻 等 现 象［10］。 因 此，如何在对这些低聚糖类含量和种类精确检测的 基础上，有效降低其含量成为豆粕产品加工的重要 内容。目前大豆低聚糖的检测方法主要有纸色谱 法、薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等。 1． 1 高效液相色谱法（ HPLC）
ELSD 检测的是不挥发的溶质颗粒，它的响应 值与被测物质的质量成正比，因而其相应值与被测 物质的 官 能 团 和 光 学 性 质 无 关，通 用 性 更 为 广 泛［14］。ELSD 不仅能够弥补紫外检测器不能检测无 紫外吸收或只有紫外末端吸收物质的缺陷，而且与 ＲID 相比，灵敏度高，不受温度等实验条件的影响， 可用于梯度洗脱等优点。宋娟娜使用 HPLC － ELSD 检测酸羊奶中的水苏糖发现，在漂移管温度为 85 ℃ ，氮气压力为 35 Psi，以甲醇为流动相的条件下测
豆粕质量稳定、营养全面，是优质的植物蛋白饲 料资源，广泛应用于动物饲料之中［1］。与其他的饼 粕，如棉粕、花生粕以及菜粕等相比，豆粕具有氨基 酸平衡、消 化 率 高、适 口 性 好 等 优 点［2］。 与 动 物 性 蛋白饲料，如鱼粉、肉骨粉等相比，豆粕具有来源广 泛，价格低廉，不易被病原菌污染等优点［3］。然而， 豆粕中含有的抗营养因子降低了其养分的有效性， 极大限制了在动物饲料中的应用。为了解决这一问 题，人们开始对豆粕加以改良，提高豆粕的消化利用 率，降低其抗营养因子，如通过育种、加工和发酵等 手段来降低大豆及其制品中抗营养因子的含量。低 活性和低含量抗营养因子成为评价豆粕饲料原料优 劣的重要指标。所以，如何建立精确、快速、高效的 抗营养因子检测技术成为该领域研究的首要任务和
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得水苏糖在 2． 504 ～ 12． 52 μg 范围内线 性 关 系 良 好，相 关 系 数 为 0． 999 8［15］。 因 此 得 出 HPLC － ELSD 适合于大豆低聚糖的检测。ELSD 的缺点是 不能检测挥发性物质，而且它所使用的流动相都是 挥发性溶剂，对于以非挥发性缓冲盐为流动相的物 质不能进行检测［16］。 1． 2 酶解法
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豆粕中抗营养因子检测技术研究进展
付亭亭1 ，李爱科1，2 ，梁新晓2 ，贠婷婷2 ，王勇伟2 ，綦文涛2
( 1． 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471000; 2． 国家粮食局科学研究院，北京 100037)
摘 要： 豆粕蛋白质含量高，营养成分比较平衡，是单胃动物很好的日粮蛋白源，在动物饲料中的应 用有着广阔的发展前景。但是，豆粕中存在的大豆抗原蛋白( 致敏因子) 、低聚糖、植酸以及致甲状 腺肿素等多种抗营养因子极大限制了其推广应用。介绍了豆粕中 3 种主要抗营养因子检测方法的 研究进展和应用效果，对其存在的问题进行了总结，并对未来发展趋势进行了展望。 关键词： 豆粕; 大豆低聚糖; 植酸; 抗原蛋白; 检测技术 中图分类号： TS 217． 3 文献标识码： A 文章编号： 1007 － 7561（ 2014） 01 － 0085 － 06
ＲID 检测原理是基于溶质随流动相洗出的溶液 与流动相折射率差异，其差值大小反映流动相中溶 质浓度。朱建华等人采用 ＲID，以 1． 0 mL / min 的 68% 乙腈为流动相，柱温 30 ℃ ，氨基色谱柱进行分 离，实验得到水苏糖和棉籽糖的线性范围分别为0 ～ 0． 75 g / L 和 0～ 1． 0 g / L，最低检测浓度分别为 4． 91 × 10 － 6 g / L 和 5． 76 × 10 － 6 g / L［11］。王晓岩等人建 立了用 HPLC 同时测定大豆中棉籽糖和水苏糖含量 的方法。采用 ＲID，以 1． 0 mL / min 的 60% 乙腈为流 动相，检测温度为 35 ℃ ，用氨基色谱柱进行分离，得 出水苏糖的最 低 检 测 限 为 0． 6 × 10 － 7 g，棉 籽 糖 为 0． 7 × 10 － 7 g，标准曲线的相关系数分别为 0． 999 6 和0． 999 4，平均回收率为 94． 7% 和 95． 6% ，ＲSD（ n = 10） 分别为 2． 01% 和 0． 8% 。从而得出该方法简 便易行，快速准确，可用于大豆中低聚糖含量的快速 检测［12］。ＲID 是一种通用检测器，对所有物质均 有响应，灵敏度低于一般紫外检测器，折射率对温度 和流速很敏感，检测器需要恒温，因此不适合于梯度 洗脱［13］。
高效液相色谱法是众多检测水苏糖和棉籽糖方 法中比较准确的检测方法，该方法既可以用于定量 又可以用于定性检测，同时具有高效、快速、灵敏度 高，应用范围广等优点。使用高效液相色谱检测低 聚糖时，根据其所使用的检测器不同分为两种。一 种是示差折光检测器（ ＲID） ，另一种是蒸发光散射 检测器（ ELSD） 。