类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗ ａｓ ａｉｍ ｅｄ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓ ｇｒｏＥＬ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｂ ｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ， ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍ ｔｈｅ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏＥＬ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍ ｅ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｔｅｍ ｐｌａｔｅ， ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍ ｅｒｓ ｗ ｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗ ｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｏＥ Ｌ ｇｅｎｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ． Ｔｈｅ ｇｒｏＥＬ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ １ ６４１ ｂｐ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ，ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭ Ｄ１ ９－Ｔ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｐＭ Ｄ１ ９一Ｔ—ｇｒｏＥＩ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ一２８ａ（＋ ）一ｇｒｏＥＩ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｒ ｎ Ｈ Ｉ ａｎｄ Ｈ ｉｎｄ １１Ｉ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｃｔ ｐＥＴ一２８ａ（＋ ）一ｇｒｏＥＬ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ａｎｄ Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ— ｔｉｎｇ． ＤＮ Ａ Ｍ Ａ Ｎ ａｎｄ ＢｉｏＥｄｉｔ ｓｏｆｔｗ ａｒｅｓ ｗ ｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｅｒｆｏｒｍ ｔｈｅ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ ａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔ ｈｅ ｒｅ一
霍 尔 德 菌 ｇｒｏＥＬ 基 因 并 进 行 了 蛋 白 表 达 ，表 达 的 融 合 蛋 白 大 小 约 为 ６４ ｋｕ，ＧｒｏＥＬ 蛋 白 的 分 子 式 为
Ｃ４ ｓｌ０Ｈ Ｎ ｅ Ｏ ｏＳ ，原 子 总 个 数 为 １５ ８９３，消 光 系 数 为 ３２ ５００，不 稳 定 指 数 为 ４０．３１，亲 水 性 平 均 值 为 ０．９０１。
ＨＵＡＮＧ Ｈａｉｆｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｘｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｘｉａ＠ ａｎ，ＣＡＯ Ｒｕｉｙｏｎｇ，ＬＩ Ｂａｏｂａｏ，ＮＩＥ Ｘｉｎ，ＺＨＵ
Ｓｈｕ， ＬＩ Ｇｕｏｈｕａ，ＰＥＮＧ Ｄｏｎｇｍ ｅｉ，ＬＩ Ｙ ａｙｉｎｇ，Ｗ Ａ ＮＧ Ｆｅｎｇｙａｎｇ，ＤＵ Ｌｉ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｈａｉｋｏｕ Ｃｉｔｙ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ＆ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｃｈ ｏＪ Ｈａｉｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏＪ’Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＨａｉｋｏＭ ５７０２２８，Ｃｈｉｎａ）
关 键 词 ：类 鼻疽 伯 克 霍 尔 德菌 ；ｇｒｏＥＬ基 因 ；克 隆 ；原 核 表达 ；蛋 白质 鉴 定 ；生 物 信 息 学 分 析
中 图 分 类 号 ：Ｑ７８
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：ｌ６７１—７２３６（２０１８）０２—０３０２—０８
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ ａｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏＥＬ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍ ａｌｌｅｉ
中 国 畜 牧 兽 医 ２０１８，４５（２）：３０２—３０９ Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｈ ｕｓｂａｎｄｒｙ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１６４３１／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７１—７２３６．２０１８．０２．００３
类 鼻疽 伯 克 霍 尔 德 菌 ｇｒｏＥＬ基 因的克 隆 、 原 核 表 达 及 其 蛋 白 的 生 物 信 息 学 分 析
摘 要 ：试 验 旨在 对 类 鼻 疽 伯 克 霍 尔 德 菌 ｇｒｏＥＬ基 因 进 行 克 隆 与 原 核 表 达 ，并 对 其 表 达 蛋 白进 行 生 物 信 息 ＤＮＡ 作 为模 板 ，参 考 ＧｅｎＢａｎｋ中类 鼻 疽 伯 克 霍 尔 德 菌 ｇｒｏＥＬ 基 因序 列 ，设 计 ｌ对 引 物 。通
ｇｒｏＥ１ 质 粒 转 化 至 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）感 受 态 细 胞 中 ，经 ＩＰＴＧ诱 导 表 达 ，运 用 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ方 法
进 行 蛋 白质 鉴 定 ，利 用 ＤＮＡＭ ＡＮ 和 ＢｉｏＥｄｉｔ等 软 件 进 行 生 物 信 息 学 分 析 。结 果 发 现 ，试验 成 功 克 隆 了类 鼻 疽 伯 克
黄 海峰 ，张振 兴 ，杨 小健 ，曹瑞 勇 ，李 宝 宝 ，聂 鑫 ，朱 妹 ， 李 国华 ，彭 冬梅 ，李 亚 颖 ，王 凤 阳 ，杜 丽
（海 南 大 学 热 带 农 林 学 院动 物 科 技 学 院 ，海 南 省 热 带 动 物 繁 育 与疫 病 研 究 重 点 实 验 室 ， 海 口市 动 物 基 因 工 程 重 点 实 验 室 ，海 口 ５７０２２８）
ＧｒｏＥＬ蛋 白二 级 结 构 中 ａ一螺 旋 （Ｈｈ）、延 伸 链 （Ｅｅ）、无 规 则 卷 曲 （Ｃｃ）分 别 占 ４８．７１ 、１３．１９ 和 ３８．１０ 。本 试 验
结 果 为 深 入 探 究 类 鼻 疽 杆 菌 ｇｒｏＥＬ基 因 的 分 子 作 用 机 理 奠 定 了 基 础 。
过 ＰＣＲ 扩 增 得 到 大 小 为 １ ６４１ ｂｐ的 ｇｒｏＥＬ基 因 片 段 ，将 其 连 接 至 ｐＭＤ１９ Ｔ 载 体 ，构 建 ｐＭＤ１９一Ｔ－ｇｒｏＥＬ重 组 质
粒 ，经 ＢａｍＨ Ｉ和 ＨｉｎｄⅢ双 酶 切 鉴 定 正 确 后 ，构 建 重 组 质 粒 ｐＥＴ一２８ａ（＋ ）一ｇｒｏＥＬ。 将 鉴 定 正 确 的 ｐＥＴ ２８ａ（＋ ）
霍 尔 德 菌 ｇｒｏＥＬ 基 因 并 进 行 了 蛋 白 表 达 ，表 达 的 融 合 蛋 白 大 小 约 为 ６４ ｋｕ，ＧｒｏＥＬ 蛋 白 的 分 子 式 为
Ｃ４ ｓｌ０Ｈ Ｎ ｅ Ｏ ｏＳ ，原 子 总 个 数 为 １５ ８９３，消 光 系 数 为 ３２ ５００，不 稳 定 指 数 为 ４０．３１，亲 水 性 平 均 值 为 ０．９０１。
ＨＵＡＮＧ Ｈａｉｆｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｘｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｘｉａ＠ ａｎ，ＣＡＯ Ｒｕｉｙｏｎｇ，ＬＩ Ｂａｏｂａｏ，ＮＩＥ Ｘｉｎ，ＺＨＵ
Ｓｈｕ， ＬＩ Ｇｕｏｈｕａ，ＰＥＮＧ Ｄｏｎｇｍ ｅｉ，ＬＩ Ｙ ａｙｉｎｇ，Ｗ Ａ ＮＧ Ｆｅｎｇｙａｎｇ，ＤＵ Ｌｉ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｈａｉｋｏｕ Ｃｉｔｙ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ＆ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｃｈ ｏＪ Ｈａｉｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏＪ’Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＨａｉｋｏＭ ５７０２２８，Ｃｈｉｎａ）
关 键 词 ：类 鼻疽 伯 克 霍 尔 德菌 ；ｇｒｏＥＬ基 因 ；克 隆 ；原 核 表达 ；蛋 白质 鉴 定 ；生 物 信 息 学 分 析
中 图 分 类 号 ：Ｑ７８
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：ｌ６７１—７２３６（２０１８）０２—０３０２—０８
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ ａｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏＥＬ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍ ａｌｌｅｉ
中 国 畜 牧 兽 医 ２０１８，４５（２）：３０２—３０９ Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｈ ｕｓｂａｎｄｒｙ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１６４３１／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７１—７２３６．２０１８．０２．００３
类 鼻疽 伯 克 霍 尔 德 菌 ｇｒｏＥＬ基 因的克 隆 、 原 核 表 达 及 其 蛋 白 的 生 物 信 息 学 分 析
摘 要 ：试 验 旨在 对 类 鼻 疽 伯 克 霍 尔 德 菌 ｇｒｏＥＬ基 因 进 行 克 隆 与 原 核 表 达 ，并 对 其 表 达 蛋 白进 行 生 物 信 息 ＤＮＡ 作 为模 板 ，参 考 ＧｅｎＢａｎｋ中类 鼻 疽 伯 克 霍 尔 德 菌 ｇｒｏＥＬ 基 因序 列 ，设 计 ｌ对 引 物 。通
ｇｒｏＥ１ 质 粒 转 化 至 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）感 受 态 细 胞 中 ，经 ＩＰＴＧ诱 导 表 达 ，运 用 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ方 法
进 行 蛋 白质 鉴 定 ，利 用 ＤＮＡＭ ＡＮ 和 ＢｉｏＥｄｉｔ等 软 件 进 行 生 物 信 息 学 分 析 。结 果 发 现 ，试验 成 功 克 隆 了类 鼻 疽 伯 克
黄 海峰 ，张振 兴 ，杨 小健 ，曹瑞 勇 ，李 宝 宝 ，聂 鑫 ，朱 妹 ， 李 国华 ，彭 冬梅 ，李 亚 颖 ，王 凤 阳 ，杜 丽
（海 南 大 学 热 带 农 林 学 院动 物 科 技 学 院 ，海 南 省 热 带 动 物 繁 育 与疫 病 研 究 重 点 实 验 室 ， 海 口市 动 物 基 因 工 程 重 点 实 验 室 ，海 口 ５７０２２８）
ＧｒｏＥＬ蛋 白二 级 结 构 中 ａ一螺 旋 （Ｈｈ）、延 伸 链 （Ｅｅ）、无 规 则 卷 曲 （Ｃｃ）分 别 占 ４８．７１ 、１３．１９ 和 ３８．１０ 。本 试 验
结 果 为 深 入 探 究 类 鼻 疽 杆 菌 ｇｒｏＥＬ基 因 的 分 子 作 用 机 理 奠 定 了 基 础 。
过 ＰＣＲ 扩 增 得 到 大 小 为 １ ６４１ ｂｐ的 ｇｒｏＥＬ基 因 片 段 ，将 其 连 接 至 ｐＭＤ１９ Ｔ 载 体 ，构 建 ｐＭＤ１９一Ｔ－ｇｒｏＥＬ重 组 质
粒 ，经 ＢａｍＨ Ｉ和 ＨｉｎｄⅢ双 酶 切 鉴 定 正 确 后 ，构 建 重 组 质 粒 ｐＥＴ一２８ａ（＋ ）一ｇｒｏＥＬ。 将 鉴 定 正 确 的 ｐＥＴ ２８ａ（＋ ）