人民医院基因扩增实验室EB病毒核酸定量检测标准操作程序

人民医院基因扩增实验室EB病毒核酸定量检测标准操作程序
1 项目名称
单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测
2 检验方法名称
TaqMan荧光定量检测
3 方法学原理
用一对EB病毒特异性引物和一条EB病毒特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。

探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。

每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。

被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

4 标本要求
4.1 适用标本类型：全血。

4.2 标本采集
a ) 全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注
入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的玻
璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静
脉血充分混匀，密闭送检。

5 试剂
5.1 试剂名称：EB病毒病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司；
5.3 试剂货号：#DA-B065；
5.4 包装规格：20人份/盒；
5.5 试剂成份：
5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。

6 仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
7 操作步骤
7.1 DNA提取
7.1.1 阴性质控品处理
a ) 取出阴性质控品，8,000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml
灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；
b ) 12000r/min离心5min，备用。

7.1.2 标本处理
7.1.2.1 全血
a ) 取全血1ml至干燥玻璃试管中，加入生理盐水1ml轻摇混
匀；
b ) 取干燥玻璃试管卷入500µl淋巴细胞分离液；
c ) 将稀释好的全血用加样枪缓慢加入加有淋巴细胞分离液
的试管中（注意沿管壁，速度要慢）；
d ) 2000rpm离心20min；
e ) 吸取白细胞层（从上而下的第二层），加入1.5ml离心管，
12000rpm离心5分钟；12,000 rpm离心5分钟；
f ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃
恒温处理10±1分钟；
g ) 12000r/min离心5min，备用。

7.1.3 EBV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.4 EBV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.5 EBV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用；
7.2 PCR扩增
7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（EBV PCR反应液40µl/人份+ Taq酶3µl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq 酶，充分混匀后按43µl/管分装至0.2ml离心管中备用。

7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2µl，或直接加入阳性定量参考品2µl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下
93℃2分钟预变性；
93℃45秒→55℃60秒10个循
环
93℃30秒→55℃45秒30个循环
8 结果判断：
8.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则实验结果判为样品的HSVⅡDNA总含量小于检测下限。

8.2 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则：
a ) 若样品的C<5.00E+003，则该样品的EBV DNA总含量<5.0
×103基因拷贝/ml；
b ) 若样品的5.00E+003≤C≤5.00E+007，则该样品的EBV
DNA总含量=C基因拷贝/ml；
c ) 若样品的C>5.00E+007，则该样品的EBV DNA总含量>5.0
×107因拷贝/ml。

如果需要精确定量结果，可将提取后的
样品稀释至线性范围内再检测。

9 质控
a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30；
b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量
参考值在1×106因拷贝/ml~2×107因拷贝/ml范围，临界
阳性质控品定量参考值在2×102基因拷贝/ml~2×104基因
拷贝/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）；
c ) 阳性定量参考品：增长曲线不呈S型曲线，Ct值<27，且
线性相关系数0.97≤|r|≤1；
d ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无
效，需重新进行。

10 参考范围
低于检测下限
11 性能指标
灵敏度：5.0×103基因拷贝/ml
线性范围：5.0×103基因拷贝/ml~5.0×107基因拷贝/ml
12 临床意义
早期诊断：对于EB病毒急性感染如传染性单核细胞增多症，最早出现于临床标本中的是病原体本身，采用高灵敏度高特异性的实时荧光PCR方法进行检测，可以在感染的早期明确病因。

鼻咽癌的监测治疗：鼻咽癌具有对放疗敏感，易复发和远处转移等特点。

虽放疗为鼻咽癌的首选治疗方法，但其仍有部分患者出现远处转移和局部复发导致失败。

在临床上，常会以常规体检、纤维镜、胸片等作为鼻咽癌患者复发转移的监测手段，但是
这些方法要么缺乏一定的特异性，要么缺乏一定的敏感性，难以及时发现并实施早期治疗，且不能区分原发和转移癌。

因此，采用实时荧光PCR直接定量测定血液中EB病毒DNA，则可以及时准确的反映其在患者体内的消长情况，作为鼻咽癌治疗预后，转移和复发的监测指标。

EB病毒属于疱疹病毒，可引起增殖性感染和非增殖性感染。

特别是非增殖性感染，可导致细胞癌变。

被认为与传染性单核细胞增多症。

淋巴癌、胃咽癌、何杰金氏癌、慢性疲劳综合症有关13 注意事项
13.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
13.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
13.3 对每次实验进行质量控制；
13.4 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融；
13.5 自备灭菌生理盐水；
13.6 标本处理时“去上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀；
13.7 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。

如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样
后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；
13.8 为保证病原体颗粒充分裂解可转至4℃静置6~8小时；
13.9 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；
13.10 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
13.11 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

14 参考文献
中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006
中山大学达安基因股份有限公司. EB病毒核酸定量检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2009年4月，第一版/0。