女性雄激素检测指标、方法与现状

女性雄激素检测指标、方法与现状
雄激素对于维持女性正常生理功能有着关键作用，女性高雄激素血症则可能导致多毛、肥胖、座疮、月经紊乱等一系列临床症状。

但是，目前雄激素的测定项目与测定方法仍未取得一致共识，且高雄激素血症的诊断标准尚存巨大争议。

目前世界范围内，应用于临床检测雄激素的方法主要为免疫测定法，包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、直接放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）和化学发光法（chemiluminesce immunoassay）。

但是，由于女性血清雄激素含量低，这些方法用于雄激素检测的敏感度低、准确性差；液气相层析串联质谱分析法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry method，LC/MS-MS）（gas chromatography-tandem mass spectrometry method，GC/MS-MS）是國际认定检测甾体类激素的金标准，但是该方法目前难以应用于临床。

因此，目前可能有大部分高雄激素血症的女性患者存在漏诊。

标签：高雄激素血症；睾酮；免疫测定法；高效液相色谱
雄激素对于维持女性正常生理功能有着关键作用，雄激素代谢异常可发生在女性青春期、生育期、绝经期等各个阶段。

女性高雄激素血症则可能导致多毛、肥胖、脱发、座疮、月经紊乱、性欲亢进、阴蒂肥大等临床症状，甚至引起女性男性化[1]。

另外，雄激素在女性糖尿病、高血压、高脂血症等代谢性疾病以及心血管疾病的作用受到越来越多的关注。

1 雄激素的检测指标
女性体内的雄激素主要有睾酮（T）、雄烯二酮（A4）、脱氢表雄酮（DHEA）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）以及双氢睾酮（DHT）等。

睾酮是血液中的主要雄激素，其在血液循环里存在3种形式：健康妇女血液中，60%～65%与β-球蛋白，即类固醇性激素结合球蛋白（SHBG）结合；35%～40%与白蛋白疏松结合，仅有1%～3%睾酮以游离型（具有生物活性）存在。

由于与白蛋白结合较为疏松，因此有部分与白蛋白结合的睾酮可以被组织利用，所以具有生物活性的睾酮是指未与SHBG结合的睾酮，它们能与雄激素受体相互作用来调节雄激素靶基因表达[2]。

SHBG是一种糖蛋白，在肝脏中合成，含有与雄激素结合的单一位点，睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮以及雌二醇与其结合后丧失活性。

SHBG 浓度与多种因素有关；甲状腺功能亢进、妊娠和雌激素治疗增加SHBG的水平。

相反，肥胖、肾上腺皮质类激素、雄激素、孕酮、生长激素、胰岛素降低SHBG 水平。

因此，与SHBG结合的雄激素水平波动很大。

妇女的年龄、营养状况，性激素水平，饮食习惯，服药情况（口服避孕药或影响肝脏功能的药物），基础疾病（如肥胖、甲状腺疾病、糖尿病、肝肾疾病等）均对SHBG产生影响，进而使游离的具有活性雄激素产生波动。

目前雄激素的测定项目与测定方法仍未取得一致共识，且高雄激素血症的诊断标准尚存巨大争议。

目前临床采用mFG评分和痤疮评分来诊断临床高雄激素血症。

而对于雄激素的生化检测，唾液中甾体激素浓度仅部分反映血液水平变化，
测定方法也不实用，唾液中激素水平和血清水平间的相关性尚不明确，也未有唾液睾酮水平与临床症状间关系的报道[3]。

因此，雄激素水平的检测样本仍以血清为主。

但是很多因素可以影响其检测结果，如年龄、月经、口服避孕药和雌激素治疗、妊娠、肥胖等，且分析方法和标本预处理的不同同样较明显的引起其结果的差异。

在所有雄激素中，睾酮具有较高的生物学活性，因此血清睾酮（总睾酮和游离睾酮）是临床上评估雄激素生物学活性最常检测的指标。

2 雄激素的检测方法
2.1 免疫测定法
免疫测定方法包括直接放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）、化学发光法（chemiluminesce immunoassay）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）等，是目前雄激素检测的主要手段。

遗憾的是，由于女性血液中睾酮浓度较低，尤其是游离睾酮，浓度极低，较男性大约低10倍，美国病理学会（College of American Pathology，CAP）提供的这些常规睾酮检测方法存在明显缺陷[4]，灵敏性差，只适用于成年男性睾酮的测定（>200 ng/dl），不适用于女性，即使用最好的操作技术及精密尖端的的自动分析仪器也有很大误差。

而且，目前临床实验室常用的免疫测定法有如下缺点：（1）样本只能进行单一指标测定；（2）方法主要辨识抗体的结构、而不是功能，易受甾体激素相似结构代谢物的影响，尤其在低浓度范围，这使得该方法测得结果变异度大，易发生误诊；（3）灵敏度和准确性差，妇女最为显著，女性的雄激素水平往往超出工作曲线直线部分最低检测范围，结缺乏可靠性；（4）杂质干扰，无内部校准系统；（5）不同试剂盒测量结果不同，各实验室间结果缺乏可比性；（6）缺乏可靠的正常值范围，各个实验室所指定的正常值范围不同，缺乏可比性。

这些缺陷使睾酮和游离睾酮的测定更加复杂化[3-5]。

笔者研究表明，由于测定的准确性差，生化高雄与座疮、多毛等临床高雄表现之间的相关性并不理想。

目前认为采用萃取色谱法预处理和放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）测定总睾酮，以及应用平衡透析法（equilibrium dialysis）和超速离心法测定游离睾酮结果较可靠[6]。

即应用同位素平衡技术，有机溶剂萃取，硫酸铵沉淀SHBG，氚标记孵化血清睾酮，而后应用放射免疫法测定睾酮。

放射免疫法及平衡透析法费事费力，温度控制严格，价钱昂贵，难以大规模应用。

另外，临床常应用游离雄激素指数（FAI）反应体内发挥生物学作用的雄激素水平，计算公式为TT/SHBG*100[7]，但是，这同样依赖于TT和SHBG的准确测量，而且也受血液SHBG和睾酮的影响，由于SHBG浓度较高，而睾酮浓度较低，因此假阳性率较高。

2.2 液气相层析串联质谱分析法
液气相层析串联质谱分析法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry method，LC/MS）（gas chromatography-tandem mass spectrometry method，GC/MS）结合了气相或液相光学仪器的分辨力以及质谱的高特异性，特异地检测从液柱或气柱洗脱出来的分析物的结构信息。

质谱分析联合气液相层析法的应用改善了甾体类激素测定的精准性，包括妇女儿童在内的所有患者均可以较为准确地测定甾体类激素水平，质谱分析测定方法程序已经被确定为甾体类
激素测定的“金标准”，它解决了既往检测方法低阈值低灵敏度的问题，该方法将为睾酮提供试剂盒以及为激素水平的测定提供标准参照[8]。

目前世界范围已有三个实验室获得批准进行RMP（reference measurement procedure）睾酮测定，建立LC/MS的标准RMP测定方法。

2个在欧洲实验室，使用同位素稀释气相色谱-质谱法ID-GC/MS-MS，另外一个是美国NIST（National Institute of Standards and Technology）基于同位素稀释液相色谱串联质谱ID-LC/MS-MS，RMP用于为常规测定方法提供试剂盒、测量参考标准的和高水准校准[9]。

NIST已报道，睾酮测定的下线范围可以达到1～8 ng/dl（0.035～0.30 nM），刚好满足妇女睾酮测定的需要[10]。

国外一些学者采用4种常规免疫测量法与液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）对健康受试者进行睾酮的测量结果进行比较，发现在4种常规免疫测定法与LC/MS法结果比较中，只有1种免疫测定法在测定女性的睾酮与孕酮<1 mg/L则与LC/MS结果有相关性，而其余3种免疫法的测定结果与LC/MS测出的结果均有较大差异。

结果表明，常规免疫法在测定女性低浓度循环类固醇时明显受限，LC/MS法更敏感和值得信赖[11]。

很多研究报道改进LC/MS-MS的方法以增强睾酮测量的敏感性。

同位素稀释法的应用大大增强了LC/MS-MS的敏感性，同位素稀释-液相层析串联质谱分析法（Isotope-Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，ID-LC/MSMS）联合了丹酰基氯化物衍生作用，降低雄激素间内部代谢产物干扰，提高了测量的灵敏性和精准性。

筆者课题组曾行预实验，采用LC-MS/MS检测PCOS和对照组妇女的血清FT，并对比ELISA方法检测两者的FT，可发现ELISA测定两组可两者的差距并不明显，而LC-MS法则可以明显区分PCOS和对照正常妇女的血清游离睾酮水平。

目前该测量方法的问题在于，很少医院实验室有质谱仪设备，因为其设备以及人力费用昂贵，而且保养维修繁琐，花费时间长，该设备难以普及，难以应用于临床。

且检验效率低，样本处理有限。

但LC/MS未来将成为睾酮检测的主导方法。

将其应用于临床检测，医生及专家可以得到更加接近真实值的结果，更加准确地诠释其临床意义，用于诊断和治疗。

3 高雄激素血症与多囊卵巢综合征
高雄激素血症是多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）的基本特征之一。

约有5%～10%育龄妇女受其影响，其中70%～80%PCOS妇女会导致高雄激素血症[12]。

有研究发现，高雄激素血症可能与PCOS的远期糖脂代谢障碍、心血管疾病等并发症危险性高度相关[12]。

高雄激素血症的早期发现，对于PCOS的早期诊断与干预具有重要意义，从而采取相应措施预防其远期并发症。

但是，由于目前雄激素的检测方法存在缺陷，且高雄激素血症的诊断标准尚未确立，因此可能有大部分高雄激素血症的女性患者存在漏诊，对PCOS的早期准确诊断造成一定的困难。

参考文献
[1] Rothman M S，Carlson N E，Xu M，et al.Reexamination of testosterone，
dihydrotestosterone，estradiol and estrone levels across the menstrual cycle and in postmenopausal.women measured by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Steroids，2011，76（12）：177-182.
[2] Yeap B B，Wilce J A，Leedman P J.The androgen receptor mRNA[J].Bioessays，2004，26（6）：672-682.
[3] Turpeinen U，H?m?l?inen E，Haanp?? M，et al.Determination of salivary testosterone and androstendione by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Clin Chim Acta，2012，413（5-6）：594-599.
[4] Swerdloff R S，Wang C.Free testosterone measurement by the analog displacement direct assay：old concerns and new evidence[J].Clin Chem，2013，54（3）：458-460.
[5] Wang C，Catlin D H，Demers L M，et al.Measurement of total serum testosterone in adult men：comparison of current laboratory methods versus liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Clin Endocrinol Metab，2004，89（2）：534-543.[6] Davison S L，Bell R，Donath S，et al.Androgen levels in adult females：changes with age，menopause，and oophorectomy[J].J Clin Endocrinol Metab，2005，90（7）：3847-3853.
[7] Yeap B B.Testosterone and ill-health in aging men[J].Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2009，5（2）：113-121.
[8] Kushnir M M，Rockwood A L，Roberts W L，et al.Liquid chromatography tandem mass spectrometry for analysis of steroids in clinical laboratories[J].Clin Biochem，2013，12（44）：77-88.
[9] Kher T，Pichler P，Swart R.Quality control in LC-MS/MS[J].Proteomicsll，2011，11（20）：1026-1030.
[10] Koal T，Schmiederer D，Pham-Tuan H，et al.Standardized LC–MS/MS based steroid hormone profile-analysis[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，2012，129（3）：129-138.
[11] Fanelli F，Belluomo I，Di Lallo V D，et al.Serum steroid profiling by isotopic dilution-liquid chromatography-mass spectrometry：comparison with current immunoassays and reference intervals in healthy adults[J]. Steroids，2011，76（3）：244-253.
[12] Ghada El-Kannishy，Shaheer Kamal，Amany Mousa，et al.Endothelial function in young women with polycystic ovary syndrome（PCOS）：implications of body mass index （BMI）and insulin resistance[J].Obesity Research & Clinical
Practice，2009，4（1）：49-56.
（編辑：王韵）。