小麦TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定

比对搜索，找出小麦中相关的EST序列后进行电子
在WRKY基因特异引物的两端引入酶切位点
拼接，获得包含完整开放阅读框（ORF）的cDNA序列 （XbaⅠ和KpnⅠ）（ P3-L和P3-R，表1），用于构建超表达
扩增，反应总体积为20μL，包括反转录产物2μL、 10mmolL-1dNTPs0.4μL、20ngμL-1基因特异引物
胁迫调控[7]。另外，一些WRKY基因在植物生长发育 2uL、Taq DNA聚合酶1 U。PCR扩增程序为94℃5min；
过程中起重要作用。GaWRKY1在棉花中参与次生代 谢物的合成，AtWRKY6调控叶片衰老及成熟[8-10]。由
为设计引物构建融合表达载体，在WRKY基因
75%。至三叶期，对幼苗进行干旱（20%PEG，， 2h和4h）、 特异引物上游和下游分别引入EcoRⅠ与Hind Ⅲ的酶 低温（3℃，30min和60min）、高温（40℃，20min和 切位点（P2-L和P2-R，表1），从农大3338分蘖盛期叶
40min）及高盐（10%NaCl，20min和40min）胁迫处 片cDNA中扩增出带有以上酶切位点的ORF片段，
govblastcgi进行同源16拟南芥超表达载体构建和转化比对搜索找出小麦中相关的est序列后进行电子wrky基因特异引物的两端引入酶切位点拼接获得包含完整开放阅读框ore的edna序列xba和xpnip3和p3r表1用于构建超表达万方数据作物学报第39本研究所用引物tableprimersusedstudy引物引物序列用途primersequenceinformation5?31purposep1一factccatttccgatcggtcgatt基因克隆aagaactgtcccacacgtcagacaaggenecloningcatcgaggtgcacgacgatttc扩增全长基因所用的yrace引物ctactgtacgggcccatgttcttc3raceprimersfulllengthgenectgatctagaggtaccggatccaggagtaggtgatgagcac扩增全长基因所用的57race引物ccttcgagctactgcacctgtag5raceprimerslengthofthegenegtccatgcaacacgatcggag慷一一ggccacgcgtcgactagtacggggggggggggccacgcgtcgactagtaccagcaactgggatgatatgg内标对照atttcgctttcagcagtggtreferencegenecontrolccggaattcatggacggcgagtggagc亚细胞定位所用引物cccaagcttgctcacgtcatggcagtgcprimerssubcellularlocationtgctctagacatggacggcgagtggag超表达所用引物一一撕冰妍娘cggggtaccgctcacgtcatggcagtgcprimersoverexpression载体
Abstract:WRKY transcription factors are specific in plants and related in response to stress as well as plant development In this study,we cloned the full-length cDNA of a new WRKY transcription factor gene,TaWRKY44,from wheat(Triticum aestivum L). The open reading frame of TaWRKY44 is 897 bp in length,which encodes 298 animo acid residues The semi-quantitative RT-PCR result indicated that TaWRKY44 was highly expressed in leaf,and responsive to drought and clod stresses TaWRKY44 over-expressed lines of Arabidopsis exhibited smaller leaves,shorter leaf petioles,and smaller leaf epidermis cell than the wild type In addition,the transgenic lines were more sensitive to abscisic acid,drought,and salt stresses. These results indicated TaWRKY44 could be a negative regulator in stress signal transduction pathway Keywords:Wheat;WRKY;Gene expression;Leaf;Abiotic stress;Functional analysis
94℃1min，63℃1min,72℃1.5min,35个循环；最 后72℃5min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳后，
此可见，WRKY转录因子对于植物胁迫响应及调控 将目标片段进行回收、克隆和测序。根据RT-PCR产
生长发育具有重要的作用。 最近，Niu等[4]克隆了43个小麦WRKY基因，并
物的测序结果，设计5′和3′RACE引物（表1），用 5′-Full RACE Kit with TAP试剂盒和3′-Full RACE
1.1 植物材料及处理 2011年9月在中国农业大学上庄试验站田间种
迫处理，提取RNA并反转录。以β-actin为内标基因进
行半定量RT-PCR分析，引物序列见表1。反应总体积为 20μL，包括反转录产物2μL、10×buffer2μL、10mmolLdNTPs0.4μL、20ngμL-基因特异引物（P1-L和
对其中2个基因（TaWRKY2和TaWRKY19）的功能进 Core Set with PrimeScript RTase（TaKaRa）进行全长
行了鉴定，发现TaWRKY2和TaWRKY19可能参与植 cDNA的克隆。同源进化分析采用ClustalX软件。
物非生物逆境胁迫过程。在本研究中，我们克隆了 1.4 基因表达模式的分析
1.3 基因克隆和同源进化分析 按照吴华玲等5]报道的方法，以拟南芥和水稻
中已报道的WRKY基因为搜索序列，在GenBank数据
1100psi，轰击距离约为5cm。轰击的洋葱表皮细胞 于22℃培养箱中培养14～16h，于激光共聚焦显徽镜 下（Leica,TCSSP2）观察GFP的表达定位。
库中（http：///Blast.cgii）进行同源 1.6 拟南芥超表达载体构建和转化
Svnthesis SuperMixKit（TransGen Biotech）ห้องสมุดไป่ตู้作说明 合成cDNA，-20℃保存备用。
切，凝胶电泳后回收片段与同样双酶切后线性化的 pEGAD载体（由中国农业大学生物学院巩志忠教授 提供）连接，获得绿色荧光蛋白与目的基因的融合蛋 白表达载体。
取一块长、宽大约4cm的洋葱幼嫩表皮，在固 体MS培养基上22℃培养3～4h。采用PDS-1000/He基 因枪（Bio-Rad）轰击洋葱表皮细胞，可裂膜压力为
小麦TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定
王
瑞 1,2，**
孙其信 ， 1,2 *
吴华玲3，**
王会芳1,2
黄
珂 1,2
霍春艳1,2
倪中福 1,2
1农业生物技术国家重点实验室/北京市作物遗传改良重点实验室/中国农业大学，北京 100193;2国家植物基因研究北京中心，北 京100193;3广东省农业科学院茶叶研究所，广东广州 510640
摘 要：WRKY是植物特有的转录因子基因，在植物对外界胁迫响应及生长发育的过程中发挥重要作用。本研究克隆 了一个新的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY44，获得其全长cDNA，其中开放阅读框长度为897bp，编码298个氨 基酸。半定量RT-PCR的结果表明，TaWRKY44在叶片中表达水平较高，并且受干旱和低温胁迫诱导表达。转基因功 能分析结果表明，TaWRKY44的拟南芥超表达株系叶片变小，叶柄缩短，并且叶片细胞也明显小于野生型。另外，转 基因系对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性也高于野生型，说明该基因可能作为一个转录抑制子参与逆境胁迫信 号转导过程。 关键词：小麦；WRKY;基因表达；叶片；逆境胁迫；功能分析
Cloning，Characterization,and F unctional A nalysis of Ta WRK Y44 Gene from
Wheat
WANG R ui1,2,**,WU Hua-Ling3,**,WANG H ui-Fang1,2,HUANG K e1,2,HUO Chun-Yan1,2,NI Zhong-Fu1,2, and SUN Qi-Xin1,2,* 1State Key Laboratory for Agrobiotechno1ogy/Beijing Key Laboratory of Crop Genetic Improvement/China Agricultural University,Beijing 100193,China;2National Plant Gene Research Centre(Beijing),Beijing 100193,China;3Tea Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510640,China
一个小麦WRKY基因TaWRKY44，在表达模式分析
取农大3338分蘖盛期的叶片、根、分蘖节、授
的基础上，对其功能进行了鉴定，为深入探讨 粉后12 d的种子、苗期、开花期和衰老期的叶片，提
TaWRKY44基因与植物生长发育的关系奠定了基础。 取RNA并反转录。同时取苗期农大3338幼苗进行胁
1 材料与方法
植物能够感知并传递胁迫信号，激活下游转录因子， 后进行氨基酸序列比对分析，筛选出未报道的新基
启动抗逆相关基因的表达，从而促使植物体内发生 因，然后设计基因特异引物P1-L和Pl-R（表1），再分
一系列的生理生化反应，抵御不良环境的危害并提 别以农大3338DNA和分蘖节cDNA为模板进行PCR
高植物的耐逆性。HvWRKY38在大麦中参与调控对 干旱胁迫的响应6]，AtWRKY8在拟南芥中则参与盐
基因是由多个成员组成的大家族。在小麦中，迄今 仅克隆了58 个W R K Y 基因4-5]。因此，分离和克隆
小麦新的W RKY 基因，并鉴定其功能，将为探讨 WRKY基因与小麦生长发育的关系奠定重要基础。
研究发现，植物W R K Y 转录因子基因广泛参与 植物对生物及非生物胁迫的响应。在逆境胁迫下，
植小麦品种农大3338，取分蘖盛期的叶片、分蘖节、 根系、开花期叶片、衰老期叶片及授粉后12d的种 子提取RNA，其中全长cDNA克隆材料为分蘖节。在 光照培养箱中，将小麦种子置培养皿滤纸上萌发， 培养条件为26℃（16h）/20℃（8h）（昼/夜），相对湿度
P1-R）2μL、TaqDNA聚合酶1U。PCR扩增程序为 94℃，5min；94℃1min,60℃1min,72℃1.5min,25 个循环；最后72℃延伸5min。设3个生物学重复。 1.5 W RKY转录因子的亚细胞定位
本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项（2011ZX08009-084B），国家自然科学基金重大项目（31290210）和国家高技术研究发 展计划（863计划）项目（2012AA10A309）资助。 *通讯作者（Corresponding author）：孙其信，E-mail:qxsun@ 第一作者联系方式：E-mail：worryrrow@ **同等贡献（Contributed equally to this work） Received（收稿日期）：2013-03-18；Accepted（接受日期）：2013-06-25；Published online（网络出版日期）：2013-08-12. URL：http：///kcms/detail/11.1809.S.20130812.1750.011.html
W R K Y 基因是植物中特有的一个转录因子家族， 得名于其保守结构域中包含有一个w RKYGQK 的 序列1。早在1994 年，Ishiguro 等克隆出第一个
w RKY 蛋白SPF1，此后在许多生物相继有研究报 道。最近研究结果显示，拟南芥、水稻和玉米分别 存在72、107和139个WRKY基因[2-3]，说明WRK Y
理，并以正常生长幼苗为对照。取各处理叶片提取 将片段从琼脂糖胶回收后连接到T-easy（TaKaRa）载
RNA进行表达分析。
体上，然后以EcoRⅠ和HindⅢ对连接载体进行双酶
亚细胞定位材料为新鲜洋葱表皮。 1.2 总DNA、RNA的提取纯化和cDNA的制备
采用CTAB法提取农大3338总DNA。用TRIzol （TIANGEN）提取小麦不同组织和不同处理时间点叶 片的总RNA。按照TransScript First-Strand cDNA
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013，39（11）：1944-1951 ISSN 0496-3490；CODEN TSHPA9
D O I：10.3724/SP.J.1006.2013.01944
http：/// E-mail:xbzw@chinaj