大黄鱼复方中草药氧化氢酶基因表达

摘要
过氧化氢酶（CAT）是生物体中的一种抗氧化酶，本文以我国重要的海水养殖鱼类大黄鱼为研究对象,探究饲料中添加复方中草药对大黄鱼过氧化氢酶基因表达的影响。

通过在大黄鱼饲料中添加不同比例中草药复方（太子参、巴戟、当归、枸杞、茯苓、白术等），饲喂30天后，以大黄鱼的肾脏组织为实验材料，通过实时荧光定量PCR技术，分析饲喂中草药后CAT基因的相对表达变化。

结果显示：与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降（E2组除外），E5组的表达量下降最多（72%），E1、E3、E4组的CAT基因表达量的下降程度差不多，均在40%-50%之间，E2组的表达量比对照组升高41%，但是各组间均无显著性差异（P大于0.05）。

本研究结果为中草药作为饵料添加剂在大黄鱼饲料中的应用提供了基础数据，也为中草药作为鱼类免疫增强剂提供了前期研究基础。

关键词：大黄鱼；复方中草药；过氧化氢酶；基因表达
Abstract
In this paper, yellow croaker, an important mariculture fish in China, was taken as the re search object. In order to explore the effect of compound Chinese herbal medicine on the cata lase (CA T) gene expression of yellow croaker, this experiment analyzed the relative expre ssion changes of cat gene after feeding Chinese herbal medicine by adding different p roportions of compound Chinese herbal medicine (Pseudostellaria heterophylla, Morind a officinalis, angelica sinensis, medlar, poria cocos, atractylodes macrocephala, etc.) int o the feed of yellow croaker and taking kidney tissue of yellow croaker as experimen tal material after 30 days of feeding. The results showed that Compared with the con trol group, the expression of this gene in all the experimental groups decreased to dif ferent degrees (except the E2 group), and the expression of E5 group decreased the most (72%). the expression of CAT gene in E1, E3 and E4 groups decreased to the same degree, ranging from 40% to 50%. T he expression level of the E2 group was 41% h igher than that of the control group, but there was no significant difference among the group s (P > 0.05). This study Fruit for Chinese herbal medicine as bait additives to enhance the im munity of fish.
Key words：yellow croaker; compound Chinese herbal medicine; catalase; gene expression.
目录
1、引言 ................................................................ １1.1 大黄鱼 .............................................................. １1.2 中草药主要简介....................................................... １
1.3 CAT基因............................................................. ２
2 材料和方法 ............................................................ ３2.1材料、药品及仪器..................................................... ３2.1.1 原料鱼处理......................................................... ３2.1.2主要试剂和仪器设备................................................. ４
2.2 实验方法
............................................................ ４
2.2.1大黄鱼总RNA的提取
................................................. ４2.2.2 RNA凝胶电泳....................................................... ５2.2.3 RNA定量分析....................................................... ５2.2.4 RNA反转录......................................................... ５
2.2.5实时荧光定量PCR .................................................... ６
3 实验结果及分析......................................................... ７3.1 RNA结果分析......................................................... ７3.2 熔解曲线分析......................................................... ８
3.3 CAT基因表达分析..................................................... ８
4、讨论 ................................................................ ９4.1中草药的应用及前景................................................... ９4.2饲料中添加复方中草药对大黄鱼CAT基因表达的影响........................ ９
4.3总结............................................................... １０致谢 .................................................... 错误!未定义书签。

参考文献 .............................................................. １１
饲料中添加复方中草药对大黄鱼CAT基因表达
的影响
1、引言
1.1 大黄鱼
大黄鱼为我国特有海产鱼种，营养价值高，深受百姓喜爱，大黄鱼(Richardson)属于鲈鱼属，又称桂花黄鱼、黄金龙，属于亚热带性鱼类，分布于中的海南、东海以及黄海的南部。

作为我国“四大海洋经济鱼类”之一，黄花鱼口感很好，味道鲜美，而且富含蛋白质。

近年来，随着养殖规模的扩大，很多商家看到了大黄鱼带来的经济效益，对大黄鱼进行高密度的养殖，导致大黄鱼的疾病越来越严重，比如大黄鱼品质变差，病害频发，环境和水质的污染等，这些问题都给养殖产业带来了巨大的经济损失，从而影响了产业的发展[1,2]。

由于目前防治大黄鱼病害方法存在抗药性、药物残留等局限性，为了提高大黄鱼商业的发展，提高鱼类自身免疫已然成为人们急需探究的新课题。

1.2 中草药主要简介
中草药作为中药中的一种常见药物，从本质上讲，中草药具有毒性低、残留低等特点。

中草药来源于自然，因此成本也较低，但缺点是运行时间较长，运行速度慢。

作用机理特别，不易产生抗药性[3]。

中草药之所以能有效提高水产动物的胸腺、骨髓、脾和肾等免疫器官的指数，是因为含有糖类、黄酮类、蛋白质多肽类、醌类化合物和生物碱等生物活性物质[25-26]。

中草药在鱼类疾病的防治方面有着悠长的历史，合理使用中草药添加剂，不但可以缓解化由于抗生素和化学药物导致的问题，也可以进一步解决水产养殖中的药物残留问题,中草药有许多优点：草药不仅可以用作药物，同时也可以当作营养物使用；成分较复杂，具有抗菌、抗感染多种功效。

中草药有许多有益的
成分，中草药普遍含有促生长物质、免疫物质和比较稳定的糖类、脂类等。

免疫类的物质和蛋白氨基酸的参与可以提升鱼的免疫力和抗病能力；以不同中草药如黄芪、黄芩和党参等配制的药物饵料投喂大黄鱼，虽然对大黄鱼的非特异性免疫功能有很大的提升，但是不能使其免于特异性的感染[10]，因此中草药研究的路程还很远。

牛膝种子提取物可作为罗非鱼(Oreochromis mossambicus)的免疫增强剂,饲喂2周后,可显著提高血清溶菌酶、补体交替活性,促进细胞活性氧、反应性氮中间体和髓过氧物酶的生成[7]。

陈孝煊等发现大黄、穿心莲、板蓝根和金银花等草药，能有效提高鱼类的免疫力[13，14]。

李义等[12]用黄芪等多种中草药作为饵料增添剂，经实验发现能有效提高罗氏沼虾的免疫功能。

邹金虎等[15]发现白芍、五味子、党参、刺五加、黄芪和鱼腥草6种中草药的提取物，对鲫鱼的非特异性免疫有明显的效果，表明这些中草药能够提高鲫鱼的抗病性。

太子参是由三萜皂苷和多糖等物质组成的活性物质，可以从石竹科植物孩儿参的干燥块根中提取得到，能够提高抗病力和免疫力、抗氧化、降血糖及抗疲劳等作用，也是生活中常用的一种中草药。

太子参作为名贵的中草药其被认可的功效有：补气益脾，滋养津液。

太子参品质的高低取决于太子参根块的饱满程度、是否香味浓郁、还有就是含糖量的高低。

其药理作用有：（1）抗疲乏、缓解紧张（2）提高人体抵抗力（3）SOD样作用（4）延年益寿（5）止咳作用（6）抗病及抗菌作用。

据药学专家研究表示，太子参不仅含有锌、铜、硒、铁等丰富的微量元素，还含有大量人体必需8种氨基酸。

中草药在配比上遵循一定的规律，中草药经过复合配比，可以把功效发挥到极致。

所以，合理使用中草药可以缓解化学药物等引起的耐药性和水产养殖药物残留等问题。

研究饲料中添加复方中草药对大黄鱼CA T基因表达的影响有利于种质资源的保护以及养殖大黄鱼种质的改良具有重要意义。

本论文为试验饲料中添加复方中草药（中草药成分主要为：太子参，巴戟天，当归，枸杞，茯苓，白术等）对大黄鱼过氧化氢酶基因表达的影响。

1.3 CAT基因
过氧化氢酶（CA T），是过氧化氢酶是一种酶类清除剂，能够催化H2O2分解成水和氧气，提高机体免疫力。

1811年，Thenard发现了过氧化氢酶，1900年，Loew[4]将这种酶命名为“catalase”，在许多动植物中发现有该酶，它主要功能是去除产生活性氧的H2O2的清除剂。

作为一种含Fe的血蛋白酶类，CA T广泛存在于从单细胞生物的细
菌到高等生物的人类中，能将H2O2分解为氧和水，有效清除体内的超氧阴离子自由基(O2.-)、游离氧(O)、羟基自由基(.OH)等活性氧物质，从而防止它们对细胞造成损伤。

在系统进化树中，大黄鱼与石首鱼科的军曹鱼首先聚在一起，进一步与其他鱼类聚类，结果发现与其他动物分支明显。

环境胁迫会提高氧自由基含量，而过氧化氢酶能清除体内多余的氧自由基和过氧化氢，且其基因表达变化或酶活力与机体的抗氧化及健康状态密切相关。

从大黄鱼中克隆出C47基因的完整开放阅读框序列，还有待于获得基因全长及上游调控序列，确定调控位点。

人体内的过氧化氢酶能提高机体免疫力，这些跟人体细胞的衰老及凋亡、肿瘤的形成，以及基因的突变有关[5,21]。

Li等[6]研究发现彭泽鲫鱼在受到重金属镉的刺激后，体内产生了活性氧，而抗氧化酶系统产生变化。

Arockiaraj 等[22]在研究罗氏沼虾时，通过注射传染性皮下及造血组织坏死病毒到罗氏沼虾体内，发现过氧化氢酶在各大组织内均有表达，而在消化道中表达最高。

这些结果表示，当受刺激时，机体内的过氧化氢酶起到了重要的防御作用。

本论文以大黄鱼为研究对象，尝试将以太子参为主的中草药作为饵料添加剂应用在大黄鱼饲料中，通过分析大黄鱼体内过氧化氢酶基因表达的变化，在一定水平上分析中草药添加剂对大黄鱼抗氧化酶系的影响，也为研究中草药影响鱼类免疫提供基础数据。

2 材料和方法
2.1材料、药品及仪器
2.1.1 原料鱼处理
实验所用大黄鱼来源于宁德市鼎诚水产有限公司自行繁育的健康、规格一致，平均体长（23.45±0.83）cm，体质量（34.05±8.23）g的大黄鱼幼鱼。

原料鱼共分六组饲养分别为：1、2、3、4、5、6（CK），养殖在1.5 T养殖桶中，养殖周期30 d，实验组饲料中添加的太子参及其他中草药浓度见表2-1，E6组为普通商品饵料。

每组设置1个平行组，每组100尾大黄鱼幼鱼。

每天分2次投喂鱼体质量1%～2%的饲料，视摄食情况酌情调整。

养殖水体水温控制在24～26℃之间，溶解氧大于5.0 mg/L，pH值维持在8.0左右，氨氮小于0.2 mg/L。

常规养殖管理，做好养殖记录。

30天以后，每组分别随机取三尾健康个体进行活体解剖采样，取肾脏组织保存于Trizol裂解液，-80℃超低
温冰箱保存备用。

表2-1 实验组中草药的具体添加量
Table 2-1 the specific amount of herbal medicine added in the experimental group
2.1.2主要试剂和仪器设备
TB Green Premix Ex Taq TM （Perfect Real time ）、rTaq DNA Polymerase 、dNTP 均购于大连宝生物公司。

DNA Marker 购自北京智达汇成科技有限公司。

Trizol 试剂购自生工。

引物由上海生物科技公司合成。

2.2 实验方法
2.2.1大黄鱼总RNA 的提取
1、研磨：取1.5 mL EP 管加入30-50 mg 组织块加入装有1 mL Trizol 的离心管中，将离心管插在装有碎冰的烧杯上进行研磨，直至没有大块组织为止。

2、取上清液移入新的离心管中，再加入1/5体积氯仿混合摇匀，冰上静5 min ，4℃、12000 g 下离心15 min 。

组别
组分 用量（%） E1 太子参 0.5
E2 太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天 各0.167
（总1.0）
E3 太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天 太子参0.5，
其他各0.1
（总1.0）
E4 太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白
术、当归、茯苓 各0.111 （总1.0）
E5 太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓、
太子参0.5，
其他各0.0625
（总1.0）
3、用合适的移液枪取上清，加入等量的预冷异丙醇（为了沉淀RNA），震荡混合，-20℃下静置20 min，温度4℃、转速同上离心10 min。

取上清时需注意宁可少取也不要取到中层蛋白和下层基因组溶液，若取到则对后续RNA纯度品质造成污染。

4、研磨之后配平，放在冰上静置5 min，在4℃、12000 g条件下离心5 min。

5、将上清液弃去后取1 毫升75%乙醇对RNA沉淀进行洗涤，条件同上离心5 min 后干燥（干燥需干燥至EP管壁无残留乙醇，若残留乙醇过多可以用灭菌过的枪头吸出，干燥至RNA沉淀由乳白转至渐透明之间，则干燥完全），加无核酸酶水20-30 μL，于-80℃冰箱保存备用。

2.2.2 RNA凝胶电泳
1.制胶：称取4.8 g琼脂糖，加40 ml 1X TAE电炉加热溶解放凉加入4 μl核酸染色剂，倒入制胶模具，待凝固成型。

2.点样：将RNA样本与RNA上样缓冲液（Loading Buffer）进行混合，将混合后的RNA样本依次点入对应的胶孔，设定程序121V，15 min，开始电泳。

3.将电泳完成的胶用凝胶成像设备观察，验证其完整性。

2.2.3 RNA定量分析
将RNA样品用超微量分光光度(Thermo Scientific)测定样品在260和280 nm的吸收值，记录RNA样品浓度OD值用于后续实验，本次实验测定出RNA OD均值所在范围，由数据得知RNA纯度较高可进行下一步实验。

2.2.4 RNA反转录
以肾脏组织的RNA为模板，PrimeScript™ IV 1st strand cDNA Synthesis Mix(Takara)试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成，总反应体系为10 μL（如表2-2）。

表2-2反转录体系
Table 2-2 Total volume of reverse transcription
引物名称各引物含量（μL）
5×Buffer 2
Enzyme Max Ⅰ0.5
OligdT 0.5
Random 6 mers 0.5
RNA 1-3
水加至10
2.2.5实时荧光定量PCR
根据大黄鱼基因组数据库中的基因序列设计引物，以β-actin作为内参基因(引物序列表2-3)，采用TB Green 预混合Ex TaqTM (Takara)试剂盒，以相对荧光定量PCR 方法检测基因，每个反重复两次。

12.5 μL反应体系如下：6.25 μL TB Green 预混合Ex Taq TM(TaKaRa)，上下游引物均为0.5 μl（2 μM），取1 μL的cDNA 进行1:10稀释，4.25 μL 水。

循环参数：在温度为95摄氏度下预变性五分钟，进行40 个循环：95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s。

PCR反应后分析熔解曲线。

重复两次实验，取平均值进行分析。

所有基因的相对表达量用2-∆∆Ct计算，所得数据用SPSS 19.0（社会科学统计软件包）统计数据，然后采用单因素方差分析（One-Way ANOV A）平均值的差异显著性（P＜0.05）。

表2-3 大黄鱼实时荧光定量PCR引物
Tab.2-3 Primers used for real-time PCR analysis from L. crocea
基因名称正向引物反向引物
gene name forward primer reverse primer
3 实验结果及分析
3.1RNA结果分析
肾脏组织的总RNA提取完成后，通过1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测，分析RNA的浓度和完整性。

经过电泳后，发现18s、28s条带清晰，RNA无明显降解，说明总RNA具有较高的完整性（图3-1）。

RNA的OD值测定是检测RNA质量的重要指标，RNA的OD260/280在1.8-2.0
之间，说明其质量较好，完整性较高，若比值大于2.2说明RNA存在降解，比值小于1.8则可能存在污染。

本实验获得的的OD260/280均值在1.7-2.2之间（表3-1），说明所提取的RNA质量较高，可继续用于后续实验。

图3-1 部分RNA电泳图
Figure 3-1Total RNA electrophoresis（partial）
表3-1RNA的定量结果
Table 3-1 The quality and quantity of RNA
样品编号OD260/280浓度（μg/μL）样品编号OD260/280浓度（μg/μL）Ki-E1-1 1.81 0.87 Ki-E4-1 2.09 1.80 Ki-E1-2 2.10 1.64 Ki-E4-2 2.12 1.50 Ki-E1-3 2.06 1.30 Ki-E4-3 2.10 1.02
Ki-E2-1 1.91 1.41 Ki-E5-1 1.93 1.40
Ki-E2-2 2.05 1.24 Ki-E5-2 2.03 1.33
Ki-E2-3 2.03 1.41 Ki-E5-3 2.03 1.21
Ki-E3-1 2.01 1.33 Ki-C1 2.03 1.12
Ki-E3-2 1.90 1.44 Ki-C2 2.02 1.55
Ki-E3-3 2.09 1.72 Ki-C3 1.93 1.30
注：Ki（Kidney）为肾脏，E为实验组，C为对照组
3.2 熔解曲线分析
特异性引物进行熔解曲线分析如图3-2所示，前面一个峰值是β-actin的溶解曲线峰图，后一个峰值是CAT的溶解曲线峰图，它们都呈现在一个峰值，说明引物有良好的特异性。

图3-2 CAT溶解曲线分析结果
Figure 3-2 Results of CA T dissolution curve
3.3 CAT基因表达分析
该基因在不同实验组中的相对表达情况如下图，结果显示，与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降（E2组除外），E5组的表达量下降最多（72%），E1、E3、E4组的CA T基因表达量的下降程度差不多，均在40%-50%之间，E2组的表达量比对照组升高41%，但是各组间均无显著性差异（P大于0.05）。

图3-3 中草药在大黄鱼肾组织中过氧化氢酶的基因表达水平.
FIG.3-3 Gene expression level of catalase in kidney tissue of L. crocea
4、讨论
4.1中草药的应用及前景
中草药作为一种免疫添加剂，是预防水产动物疾病的新型鱼药的重要发展方向。

鱼用中草药添加剂是由其主要有效成分对鱼类发挥作用,尤其是甙类、有机酸类、多糖类、生物碱、鞣质和黄酮类等有效成分黄芪和党参含有多糖类，多糖是一种能够促进动物新陈代谢和蛋白质及蛋白质酶合成的营养物质，多糖能够通过提高机体免疫基因的活性，从而达到增强免疫力的目的。

其中每一种成分都有其特别的作用效果，对预防鱼类疾病将起到关键作用，部分的糖脂蛋白氨基酸等组分能在某种程度上提升消化酶的分泌能力以及鱼类的基础代谢率，还可以进一步提高鱼类对营养物质的利用率，促进其生长发育。

其中太子参多糖具有很强的抗氧化作用，陈芳芳等[8]实验发现太子参要达到清除自由基的目的是以水溶性物质为主。

蔡巧燕等[10]为了研究太子参的抗氧化活性，通过采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法来检测抗氧化活性，实验结果表明太子参抗氧化活性最好的是内生菌株TZ-16，增加样品浓度能提高对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力。

徐先祥等[9]为了探讨太子参多糖对患有糖尿病的小鼠的抗氧化能力，通过尾静脉注射C4H2N2O4，研究表明太子参多糖能够降低丙二醛含量、提高SOD的活力。

结果表太子参多糖能提高抗氧化力。

4.2 饲料中添加复方中草药对大黄鱼CAT基因表达的影响
中草药作为饲料添加可有效提高机体自身天然免疫，其含有很多活性抗氧化物质可抑制防止生物体内不稳定自由基造成体内结构遭到破坏，另一方面中草药所含有效
成分可提高机体内其他抗氧化物的活性。

CAT作为非常重要的抗氧化酶之一，在外界环境的胁迫下，能提高机体免疫力，从而减少对机体本身的伤害，同时CA T活性会发生变化[7,8,9]。

如果体内过量的O2-被超氧化物歧化酶清除，并产生过量的H2O2，那么过氧化氢酶与谷胱甘肽过氧化物酶可以一起清除H2O2,从而达到维持机体内的正常功能[10]。

CA T在生物体的抗氧化防御系统中起着重要的作用[11],CA T活性的增加表明生物体的抗氧化能力得到了提高。

本论文是通过在饲料中添加太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天等中草药，饲喂大黄鱼30d，分析基因的相对表达变化，首先先分析中草药对大黄鱼肾脏组织中过氧化氢酶基因表达的影响。

不同实验组中的表达结果显示，大黄鱼在饲喂中草药后，CA T基因的表达发生变化，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降，E2除外，E2组的表达量比对照组升高41%（太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟），
E1、E3、E4组表达量的下降程度差不多，只有E5组表达量下降最多（太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓）。

4.3总结
从本实验结果得出大黄鱼在投喂中草药添加剂之后，肾脏组织中，除E2组之外，其余实验组中，过氧化氢酶基因的表达量均呈现不同程度的下降，尤其是E5组下降最多。

这可能是由于中草药药性较慢，需要较长时间才能提高机体抗氧化能力，本实验的喂养周期为30 d，这个周期或许对提高机体的抗氧化能力的影响不显著。

E2组下，过氧化氢酶的表达稍微提高，说明这个组分的配方在30 d时对CA T的活性有一定的诱导作用，但是后续还需要更多的工作辅佐，证实本研究的结果。

本实验研究是在基因表达层面上的分析，基因的功能最终要体现在蛋白质即酶活的水平，基因表达层面和蛋白表达层面的表达变化规律，或许会不一样，下一步的工作是要从酶活的水平上分析该基因及其他的抗氧化酶的活性变化。

总之，中草药作为饵料添加剂可以提高水产动物的免疫性能，但是考虑到生物体内复杂的生物学变化，本研究后续还有很多工作需要进行。

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