色甘酸钠滴眼液中苯扎溴铵抑菌剂量筛选研究

色甘酸钠滴眼液中苯扎溴铵抑菌剂量筛选研究
杨玲玲;张明君;李海芳
【摘要】目的检测色甘酸钠滴眼液中苯扎溴铵抑菌效力,筛选合理添加剂量.方法采用《中国药典》2015年版四部抑菌效力检查法,检测色甘酸钠滴眼液制剂中不同剂量苯扎溴铵的抑菌效力,筛选出适宜的苯扎溴铵添加量.结果所选色甘酸钠滴眼液在加入各试验菌后24h及14d的菌落对数下降值均未达到《中国药典》2015年版中眼用制剂的相应要求;苯扎溴铵在体外实验中对各试验菌有明显的抑菌作用,最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值为0.01％,最低杀菌浓度(minimalbactericidal concentration,MBC)为0.02％;在色甘酸钠滴眼液中最低抑菌剂量为0.003％.结论 0.003％～0.004％的苯扎溴铵可作为色甘酸钠滴眼液的抑菌剂添加量.%Objective To determine the antimicrobial effectiveness and the optimal concentration of benzalkonium bromide in sodium cromoglicate eye drops.Methods To investigate antimicrobial effect of sodium cromoglicate eye drops according to Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition,the in vitro antimicrobial effect and the dose screening of benzalkonium bromide in sodium cromoglicate eye drops were conducted by adding different amounts of benzalkonium bromide into
samples.Results The logarithm decrease of bacteria numbers of eye drops did not meet the eye drops standards of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition on the 24h and 14th day.Benzalkonium bromide had significant inhibitory effects on test bacteria.The MIC was 0.01％,and the MBC was 0.02％.0.003％ of Benzalkonium bromide was the minimal effective dosage in sodium cromoglicate eye drops.Conclusion 0.004％～0.005％ of
benzalkonium bromide can be used as the antimicrobial preservative for sodium cromoglicate eye drops.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2018(043)003
【总页数】5页(P319-323)
【关键词】色甘酸钠滴眼液;抑菌效力;苯扎溴铵;体外抑菌试验;剂量筛选
【作者】杨玲玲;张明君;李海芳
【作者单位】新疆维吾尔自治区食品药品检验所,乌鲁木齐830004;新疆维吾尔自治区食品药品检验所,乌鲁木齐830004;新疆维吾尔自治区食品药品检验所,乌鲁木齐830004
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1;R917
色甘酸钠滴眼液主要用于防治春季过敏性结膜炎，药物本身不具有任何抑菌作用，故各厂家在制剂中都会添加抑菌剂以保证其质量及安全性[1]。

目前市售色甘酸钠滴眼液中添加抑菌剂为苯扎溴铵和羟苯乙酯。

苯扎溴铵为季铵盐类抑菌剂，其作用机制为作用于细菌的细胞膜或竞争其辅酶，降低其表面张力，增加菌体胞浆膜和细胞器的通透性，使细胞破裂、溶解，从而达到快速抑菌的目的[2]。

但其对眼表的毒性及长期接触可能造成一定损害，体外细胞学研究表明季铵盐类抑菌剂的细胞毒性与其浓度呈正相关[3]，所以在兼顾安全性的情况下制剂中抑菌剂的量应选用最低有效量。

故本文对以苯扎溴铵为抑菌剂的色甘酸钠滴眼液进行抑菌效力检查，并
对苯扎溴铵的体外抗菌性进行考察，最终筛出色甘酸钠滴眼液中苯扎溴铵的合理添加量。

1 仪器与试剂
1.1 仪器
HWS-250恒温恒湿箱(上海精宏实验设备有限公司)、QS-PY150智能生化培养箱(上海奇珊电子科技有限公司)、LDZX-50KBS高压灭菌器(上海申安医疗器械厂)、PL602-L电子天平(梅特勒公司)、800-2型台式离心机(上海手术器械厂)。

1.2 菌种
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B)10104]、大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、白念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F)98001]、黑
曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]均来自中国食品药品检定研究院，均使用第三代传代菌种。

1.3 培养基
胰酪大豆胨液体培养基TSB(批号：20160719)、胰酪大豆胨琼脂培养基TSA(批号：20151015)、沙氏葡萄糖液体培养基SDB(批号：20150722)、沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA(批号：20160518)均来自青岛高科园海博生物技术有限公司，0.9%无菌氯化钠溶液。

培养基经适用性试验，结果符合规定。

1.4 供试品
色甘酸钠滴眼液(规格：8mL:0.16克；批号：16071501)；氯化钠(批号：160405)；苯扎溴铵：太仓制药厂提供。

2 方法与结果
2.1 菌液制备方法
取经33℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的胰酪大
豆胨液体培养物，经25℃培养2～3d的白念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物，离心收集菌体，用0.9%无菌氯化钠溶液洗脱2～3次，稀释并制成含菌数约为
108CFU/mL的菌悬液。

取经25℃培养5～7d的黑曲霉斜面培养物，加3～5mL
含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下孢子，吸出孢子悬液，用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数约为
108CFU/mL孢子悬液。

2.2 色甘酸钠滴眼液抑菌效力测定[4]
2.2.1 供试品接种
取供试品5支，将“2.1”项下制备的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白念珠菌、黑曲霉菌悬液，分别直接接种上述试验菌0.08mL于每批5支供
试品中，每支接种一种试验菌，供试品中接菌量为105～106CFU/mL，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布，然后置于20～25℃避光贮存。

2.2.2 存活菌数测定
在供试品接种6h、24h、7d、14d和28d，分别从上述每分供试品中取出1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1:10、1:100和1:1000等稀释剂测定每份供试品
中所含的菌数，测定细菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。

存活菌数测定方法适用性实验：色甘酸钠本身无抑菌作用，苯扎溴铵作为抑菌剂含量较低，因此，细菌计数及真菌计数均采用直接接种法。

验证方法，取1:10的供
试液10mL，加入0.1mL制备好的菌液，混匀，使供试液中含菌量不大于
100CFU/mL。

取含菌供试液1mL，置于无菌平皿中，注入相应的琼脂培养基，测定其菌落数。

其回收率分别为铜绿假单胞菌120%，金黄色葡萄球菌99%，大肠
埃希菌99%，白念珠菌78%，黑曲霉菌82%。

经验证，各株试验菌的回收率均大于70%，可使用平皿法进行存活菌数的测定。

2.2.3 抑菌效力试验结果判断
按“2.2.2”存活菌数测定方法，测定1mL供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值，测定结果见表1。

表1 色甘酸钠滴眼液抑菌效力存活菌数计数结果(CFU/mL)Tab. 1 The count result of antimicrobial effectiveness test of Segansuanna Cromoglicate Eye Drops注：“-”表示在所对应时间点该菌株不进行菌落计数(依据药典要求)t 铜绿假单胞菌菌数(lg值)金黄色葡萄球菌菌数(lg值) 大肠埃希菌菌数(lg值) 白念珠菌菌数(lg值) 黑曲霉菌数(lg值)初始值2.0×106(6.3) 2.5×106(6.4) 1.2×106(6.1) 3.3×105(5.5) 1.8×105(5.3) 6h 1.1×106(6.0) 4.5×105(5.7) 1.4×106(6.1) - -24h
1.4×106(6.1) 1.4×105(5.1)
2.2×106(6.3) - -7d
3.1×106(6.5) 5.5×104(
4.7)
2.9×106(6.5) 1.2×105(5.1) 1.0×105(5.0) 14d 1.8×106(6.3) 8.5×103(
3.9)
1.6×106(6.2) 1.6×105(5.2) 1.0×105(5.0) 28d 1.8×106(6.3) ＜103(＜3)
1.2×106(6.1)
2.1×105(5.3) 1.0×105(5.0)
从表1结果发现：6h时，细菌菌数的lg减少值均小于1；24h时仅金黄色葡萄球菌减少1.3 lg值，铜绿假单胞菌及大肠埃希菌lg值减少值均小于1；7d时以上3种菌lg值减少值均小于3；真菌菌数在7d及14d时的lg值减少值也均小于1。

根据《中国药典》2015年版抑菌效力检查中对眼用制剂的要求，应至少达到“B”的抑菌效力标准，即细菌24h存活菌数与接种菌数相比应下降1.0 lg，7d存活菌数下降3.0 lg，28d存活菌数未增加；由此可见，以上检测结果均不能满足《中国药典》2015年版抑菌效力中对于眼用制剂的要求。

2.3 苯扎溴铵体外抗菌试验
通过体外抗菌试验[5]，考察苯扎溴铵对5种试验菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)。

将苯扎溴铵用TSB培养基进行二倍稀释，各管中苯扎溴
铵的终浓度依次为1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25和
3.125mg/L，并设置阳性和阴性对照管。

取上述5种菌悬液的适宜稀释级0.1mL
于各抑菌试验管及阴性对照管和阳性对照管中，接种量为103～105CFU/mL药液，摇匀，细菌接种于含苯扎溴铵的胰酪大豆胨液体培养基中，置于30～35℃培养
24h。

霉菌、酵母菌接种于含苯扎溴铵的胰酪大豆胨液体培养基中，置20～25℃
培养72h。

观察试管澄明的苯扎溴铵最小浓度即为MIC，取上述5种试验用菌的MIC试管培养物0.1mL，转移至TSA或SDA平板上，测定菌数。

结果小于
5CFU/mL的确定为MBC。

经试验发现：苯扎溴铵含量高于200mg/L时，对上述5种试验菌均具有较强的杀菌作用；含量高于100mg/L时，对上述5种试验菌有较强的抑菌作用，具体结果见表2。

表2 苯扎溴铵体外抗菌试验结果Tab. 2 The antimicrobial effectiveness test of benzalkonium bromide注：“+”：长菌；“-”未长菌苯扎溴铵含量/(%,
mg/L) 铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白念珠菌黑曲霉菌1600 - - - - -800 - - - - -400 - - - - -200 -MBC - - - -100 -MIC - - - -MBC 50 + - - -MBC -MIC 25 + - -MBC -MIC + 12.5 + - -MIC + + 6.25 + - + + + 3.125 + - + + +阳性对照 + + + + +阴性对照 - - - - -
2.4 色甘酸钠滴眼液抑菌剂剂量筛选[6-8]
本次试验使用的色甘酸钠滴眼液其抑菌剂苯扎溴铵的投料浓度为30mg/L，但在正常生产存储时，含量可能会有所下降，经对该滴眼剂中苯扎溴铵采用HPLC法进
行含量测定，其实际含量为25mg/L，且该产品未能满足《中国药典》2015年版抑菌效力中对于眼用制剂的要求；由“2.3”项苯扎溴铵体外抗菌试验中得知：苯
扎溴铵含量达到100mg/L时，就会产生较强的抑菌作用。

因此，为找到苯扎溴铵在色甘酸钠滴眼液中的合理剂量，以浓度具有一定的抑菌效力及尽可能低剂量的添加为原则，特对其含量从25～100mg/L浓度之间做进一步筛选，进行5种试验
菌挑战微生物的试验。

抑菌剂剂量设计：在所选样品中加入不同剂量的苯扎溴铵溶液，进行预实验，最终确定实验组：a组含30mg/L苯扎溴铵，b组含40mg/L苯扎溴铵，c组含
50mg/L苯扎溴铵，d组含100mg/L苯扎溴铵。

以上a～d组所添加的苯扎溴铵
溶液(3,200mg/L)采用0.22μm薄膜过滤法进行过滤除菌。

实验组抑菌效力测定方法及计数方法同“2.2”项。

供试品中接种试验菌数分别为铜绿假单胞菌
1.5×106CFU/mL(6.2)，金黄色葡萄球菌
2.8×106CFU/mL (6.4)，大肠埃希菌
2.8×105CFU/mL(5.4)，白念珠菌9.6×10CFU/mL(6.0)，黑曲霉
1.8×105CFU/mL(5.3)。

经测试发现：a组供试品3种细菌计数结果相比初始值，24h细菌菌数下降均超过1 lg，7d时下降均超过3 lg，并在28d测定其菌数均未增加；真菌菌数在14d时菌数下降超过1 lg，并在28d测定其菌数均未增加，满足《中国药典》2015年版抑菌试验中眼用制剂B的要求；b组和c组供试品3种细菌计数结果相比初始值，6h菌数均下降超过2 lg，24h菌数均下降超过3 lg，并在28d测定其菌数均未恢复生长；真菌7d菌数下降超过2 lg，并在28d测定其菌数均未增加，满足《中
国药典》2015年版抑菌试验中眼用制剂A的要求。

d组供试品细菌和真菌在加入6h后平皿均无菌落生长。

因此确定色甘酸钠滴眼液终产品中苯扎溴铵的最低有效
剂量为30mg/L，具体结果见表3及图1。

表3 a～d组抑菌效力存活菌数计数结果(CFU/mL)Tab. 3 The count result of antimicrobial effectiveness test of group a～d (CFU/mL)注：①：铜绿假单胞菌；②：金黄色葡萄球菌；③：大肠埃希菌；④：白念珠菌；⑤：黑曲霉.“-”表示在所对应时间点该菌株不进行菌落计数(依据药典要求)a①7 . 0 × 1 0 5 ( 5 . 8 ) 4 . 3 × 1 0 4 ( 4 . 6 ) 1 . 6 × 1 0 3 ( 3 . 2 ) 3 . 6 × 1 0 3 ( 3 . 6 ) 5 . 5 × 1 0 3 ( 3 . 7 )②2 . 2 × 1 0 4 ( 4 . 3 ) 5 . 2 × 1 0 2 ( 2 . 7 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 .
0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )③2 . 4 × 1 0 4 ( 4 . 4 ) 7 . 5 × 1 0 1 ( 1 . 9 ) 1 0 ( 1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )④--1 . 7 × 1 0 2 ( 2 . 2 ) 5 . 5 × 1 0 2 ( 2 . 7 ) 1 . 2 × 1 0 ( 1 . 1 ) 1 . 9 × 1 0 3 ( 3 . 3 ) 1 . 3 × 1 0 3 ( 3 . 1 ) 1 . 0 × 1 0 2 ( 2 . 0 )
b①9 . 8 × 1 0 3 ( 4 . 0 ) 1 . 7 × 1 0 3 ( 3 . 2 ) 1 . 5 × 1 0 3 ( 3 . 2 ) 1 . 2 × 1 0 3 ( 3 . 1 ) 1 . 2 × 1 0 3 ( 3 . 1 )⑤--②4 . 3 × 1 0 2 ( 2 . 6 ) 7 . 0 × 1 0 ( 1 . 8 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )③2 . 0 × 1 0 3 ( 3 . 3 ) ＜1 0 (＜1 .
0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )④--1 . 5 × 1 0 ( 1 . 2 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) 1 . 6 × 1 0 3 ( 3 . 2 ) 1 . 0 × 1 0 3 ( 3 . 0 ) 7 . 2 × 1
0 ( 1 . 9 ) c①3 . 8 × 1 0 2 (2 . 6 ) 1 . 3 × 1 0 ( 1 . 1 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜
1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )⑤--②1 . 5 × 1 0
2 ( 2 . 2 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 .
0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )③1 . 5 × 1 0 3 ( 3 . 2 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 . )④--＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) 2 . 0 × 1 0 2 ( 2 . 3 ) 1 . 2 × 1 0 ( 1 . 1 ) 1 . 0 × 1 0 ( 1 . 0 ) d①＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 .
0 )⑤--②＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )③＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )④--＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )⑤--＜1 0 (＜1 .
0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 ) ＜1 0 (＜1 . 0 )
3 讨论
本文中选取的市售色甘酸钠滴眼液未能满足2015版药典对抑菌效力的最低要求，而在《中国药典》正文项下未对抑菌剂含量或抑菌效力进行要求，这就大大增加了多剂量包装眼用制剂被微生物污染的风险。

图1 a～d组抑菌效力存活菌数下降趋势图Fig. 1 The tendency chart of antimicrobial effectiveness test of group a～d
考虑到季铵盐类抑菌剂的毒性，及制剂中的抑菌剂应为最低有效剂量，认为30～40mg/L的苯扎溴铵可作为色甘酸钠滴眼液的合理添加剂量。

在此浓度区间均可满足《中国药典》2015年版抑菌试验中眼用制剂的要求，但由于抑菌剂在贮存过程中会因药物成分或包装容器等因素影响而下降，故厂家在生产时应在允许范围内增加投药量。

随着《中国药典》2015年版的实施，对抑菌效力的要求越来越严格。

理想的抑菌剂应作用迅速，使用浓度范围内安全无毒，无刺激性；不影响制剂的稳定性，可长期保持抑菌能力，与制剂中的其他成分及包装材料具有良好的相容性[9-10]，使眼用制剂在符合抑菌效力要求的前提下更加安全有效。

参考文献
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