第七章 可见分光光度法

第七章可见分光光度法
7.1 概述
7.1.1分类
吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特点而建立起来的分析方法，它包括比色分析法、可见及紫外吸收光度法以及红外光谱法等。

本章着重讨论可见光区的吸光光度法（又称分光光度法，简称光度法）。

定义：基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括比色法，可见分光光度法及紫外分光光度法等。

比色分析法：许多物质是有颜色的，例如高锰酸钾在水溶液中呈深紫色，Cu2+在水溶液中呈蓝色。

这些有色溶液颜色的深浅与这些物质的浓度有关。

溶液愈浓，颜色愈深。

因此，可以用比较颜色的深浅来测定物质的浓度，这种测定方法就称为比色分析法。

目前已普遍地使用分光光度计进行比色分析。

应用分光光度计的分析方法称为分光光度法。

这种方法具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点。

吸光光度法试液的浓度下限：10-5----10-6mol/L。

吸光光度法测定的相对误差：2%—5%，可以满足微量组分测定对准确度的要求。

7.1．2特点
分光光度法同化学分析法中的滴定分析法、重量分析法相比，有以下特点：1. 灵敏度高
分光光度法测物质的浓度下限（最低浓度）一般可达10-5~10-6mol/L，相当于含量低于0.001~0.0001%的微量组分。

如果将被测组分加以富集，灵敏度还可提高1~2个数量级。

该方法适用于微量组分的测定。

2. 准确度较高
一般分光光度法的相对误差为2~5%。

3. 操作简便，测定速度快
分光光度法的仪器设备不复杂，操作也简便。

如果采用灵敏度高，选择性好的显色剂，再采用掩蔽剂消除干扰，可以不经分离直接测定，而且速度快。

4. 应用广泛
吸光光度法既可测定绝大多数无机离子，也能测定具有共轭双键的有机化合物。

主要用于测定微量组分，也能测定含量高的组分（用示差光度法或光度滴定）。

还可测定络合物的组成、酸（碱）以及络合物的平衡常数。

7.2 基本原理
7.2.1 光的基本特性
物质呈现的颜色与光有着密切的关系。

光是一种电磁波，如果按照波长或频率排列，则可得电磁波谱图（四师P.275表10-1）。

光具有两象性：波动性和粒子性。

波动性就是指光按波动形式传播。

例如：光的折射、衍射、偏振和干涉现象，就明显地表现其波动性。

λ·ν= c
式中：λ—波长（cm）；ν—频率（赫兹）；c—光速（≈3×1010cm/s）光的粒子性：如光电效应就明显地表现其粒子性。

光是由“光微粒子”（光
量子或光子）所组成。

光量子的能量与波长的关系为：
E = hν=hc /λ
式中：E—光量子的能量（尔格）；ν—频率（赫兹）；
h—普朗克常数（6.6262×10-34J·秒）
.光色的互补关系
首先要明确什么叫单色光、复合光、可见光。

理论上将具有单一波长的光称为单色光；由不同
波长的光组合而成的光称为复合光；人眼能感觉到的光称为可见光（其波长范围大约在400~750nm之间）。

日光、白炽灯光等可见光都是复合光。

如果让一束白光（日光）通过棱镜，于是发生折射作用，便分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光。

（各色光之间没有明显的界限）。

各种色光的近似波长（见课件）。

反之，这些颜色的光按一定强度比例混合便能形成白光。

如果把两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合后，就能得到白光。

我们
便称这两种单色光为互补色光。

日光、白炽灯光等就是一对对互补色光按一定适当比例组合而成的。

互补色光的关系可用右图表示。

7．2.2. 物质对光的选择吸收
对固体物质来说，当白光照射到物质上时，如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光均匀吸收，则呈现灰色；如果选择地吸收某些波长的光，则呈现反射或透射光的颜色。

对溶液来说，溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。

当白光通过某种溶液时，如果它选择性地吸收了白光中某种色光，则溶液呈现透射光的颜色，也就是说，溶液呈现的是它吸收光的互补色光的颜色。

例如：当一束白光通过硫氰酸铁（Fe(SCN)3）溶液时，它选择性地吸收了白光中的蓝青色光，其它色光均透过溶液。

铜铵络离子的溶液因选择地吸收了白光中的黄色光而呈现蓝色。

溶液呈现不同颜色乃是由于物质对光的选择吸收所造成的。

当一束白光（强度为I0）通过下列几种溶液，溶液呈现的颜色和吸收光的关系如下图：
如果将各种波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，测定每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度A），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得一曲线，称为吸收光谱曲线（简称吸收曲线）。

是四个不同浓度KMnO
4溶液的光吸收曲线。

从图上可以看到：
溶液对不同波长的光吸收程度不同。

⑴ KMnO
4
溶液的吸收曲线形状相似，最大吸收波长不变。

⑵不同浓度KMnO
4
⑶同一物质不同浓度的溶液，在一定波长处吸光度随浓度增加而增大（这个特性可作为物质定量分析的依据）。

若在最大吸收波长处测定吸光度，灵敏度最高。

7.2.3 吸收的产生机理
7.2.3光吸收的基本定律—朗伯-比尔定律
1、 示意图
图 朗伯-比尔定律示意图
当一束平行单色光照射到任何均匀、非散射的介质（固体、液体或气体），例如溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。

如果入射光的强度为I 0，吸收光的强度为I a ，透过光的强度为I t ，反射光的强度
为I r ，则
I 0 = I a + I t + I r • （1）
在吸光光度法中，测量时都是采用同样质料的比色皿，反射光的强度基本上是不变的，其影响可以相互抵消，于是⑴式可简化为：
I 0 = I a + I t （2）
透过光强度I t 与λ射光强度I 0之比称为透光度或透光率。

用T 表示。

即
⑶
溶液的透光度愈大，说明对光的吸收愈小；相反，透光度愈小，则溶液对光的吸收愈大。

实践证明，溶液对光的吸收程度，与溶液的浓度、液层厚度以及入射光的波长等因素有关。

如果保持入射光的波长不变，光吸收的程度则与溶液的浓度、液层厚度有关。

（朗伯、比耳找出了它们的关系）
2、朗伯定律
当一束单色光通过溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱。

设入射光的强度为I 0，透过浓度为c ，液层厚度为b 的溶液，透过光的强度为I t ，由于一部分光被吸收，所以I t <I 0，如果溶液的浓度保持不变，当液层越厚时，
光在溶液中通过的路程越长，则光被溶液吸收的程度就越大，透过光的强度就越小。

照射在薄层上的光强度为I ，当光线通过该薄层后，被吸收的光强度（即减弱的光强度）
该式表示当溶液浓度一定时，光的吸收与液层
厚度的关系，称为朗伯定律。

A 称为吸光度（也称光密度D 或消光度E ），该式说明了当溶液浓度一定时，光的吸收与液层厚度的关系，称为朗伯定律。

3、 比耳定律
对于液层厚度一定而浓度不同的溶液（即颜色深浅不同的溶液）来说，光的吸收是与溶液的浓度（C ）及入射光的强度成正比，即入射光的强度减弱的情况与浓度固定而改变厚度的情况完全相似。

0t
I I T =b k T
1lg I I lg A 20⋅===
如图所示：
如果用I 表示透过光强度，则上式改为：
或
式中k 4为比例常数，与入射光波长及溶液的性质、温度有关。

比耳定律表
明：当入射光的波长、液层厚度和溶液温度一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。

4、 朗伯-比尔定律表达式 abc I I A t ==0lg 或者
，其中
透光度 0
I I T =
(透射光强度I 与入射光强度I 0之比) T A 1lg = 5、吸光系数、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度
朗伯—比耳定律中的常数K 值随c 、b 所用单位不同而不同，有两种表示方式。

1. 吸收系数a
当浓度c 的单位为g/L ，液层厚度b 用“cm ”表示时，常数K 以a 表示，称为吸光系数。

单位为L/g ·cm 。

此时，朗伯—比耳定律变为：
A = a·b·c
2. 摩尔吸收系数κ
当浓度c 的单位为mol/L ，液层厚度b 用“cm ”表示时，则K 用另一符号κ表示。

κ称为摩尔吸光系数，单位为L/mol ·cm 。

此时，朗伯—比耳定律为： c k I I lg 40⋅=c k T 1lg I I lg A 40⋅===
A = κ·b·c
κ表示浓度为1mol/L 的有色溶液在1cm 的比色皿中，在一定波长下溶液对光的吸收能力（即在一定波长下测得的吸光度数值）。

它是每个有色化合物在一定波长下的特征常数，在比色分析中用它来衡量显色反应的灵敏度，κ值越大，则该显色反应越灵敏。

例：已知含Fe 2+浓度为500微克/升的溶液，用邻二氮菲比色测定铁，比色皿长度为2cm ，在波长508nm 处测得吸光度A=0.19，计算摩尔吸光系数。

解：Fe 原子量为55.85
6 偏离朗伯—比尔定律的原因
1) 工作曲线：
根据朗伯-比尔定律，当波长和强度一定的人射光通过光程长度固定的有色溶液时，吸光度与有色溶液浓度成正比。

通常在比色分析及可见光分光光度分析中，需要绘制标准曲线(工作曲线)，即在固定液层厚度及人射光的波长和强度的情况下，测定一系列不同浓度标准溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标作图。

这时应得到一条通过原点的直线。

该直线称为标准曲线或工作曲线。

在溶液浓度较高时，标准曲线不一定为直线。

(m ol/L)108.955.8510500][Fe 662--+⨯=⨯=6108.92κκbc 0.19A -⨯⨯⨯===4
6101.110
8.920.19κ⨯=⨯⨯=-
图分光光度工作曲线
2) 非单色光引起的偏离。

非单色光引起的偏离朗伯-比尔定律的基本假设条件是入射光为单色光。

但目前仪器所提供的入射光实际上是由波长范围较窄的光带组成的复合光。

由于物质对不同波长光的吸收程度不同，因而引起了对比耳定律
的偏离。

图复合光引起的偏离(谱带a是合适的测量波长范围)
3) 化学因素引起的偏离。

朗伯-比耳定律的基本假设，除要求入射光是单色光外，还假设吸收粒子是
独立的，彼此之间无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定律。

在高浓度时(通
常>0.01mol/L)由于吸收组分粒子间的平均距离减小，以致每个粒子都可影响其
邻近粒子的电荷分布，这种相互作用可使它们的吸光能力发生改变。

一般认为比
耳定律仅适用于稀溶液。

另一方面，溶液中由吸光物质等构成的化学体系，常因条件的变化而形成新
的化合物或改变吸光物质的浓度，如吸光组分的缔合、离解，互变异构，络合物的逐级形成，以及与溶剂的相互作用等，都将导致偏离比耳定律。

7.3紫外－可见分光光度计
7.3.1、分光光度计及其基本部件
将使用光电比色计测定溶液的吸光度以进行定量分析的方法称为光电比色法。

将使用分光光度计进行测定的方法称为分光光度法。

两种方法的测定原理是相同的，所不同的仅在于获得单色光的方法不同，前者采用滤光片，后者采用棱镜或光栅等单色器。

由于两者均基于吸光度的测定，所以它们统称为光度分析法。

光度计基本部件：光源、单色器、吸收池、检测系统
图光度计的一般结构
图721型分光光度计的构造
1、光源：
在可见光区测量时通常使用钨丝灯为光源。

在近紫外区测定时常采用氢灯或氘灯产生180 - 375nm的连续光谱作为光源。

2、单色器：
滤光片-常用的滤光片由有色玻璃片制成，只允许和它颜色相同的光通过，得到的是近似的单色光。

此外，还有一类利用光的干涉作用而产生相当窄的谱带的干涉滤光片，它可提供小到10 nm宽的谱带和较大的透光度。

棱镜-光通过人射狭缝，经透镜以一定角度射到棱镜上，在棱镜的两界面上发生折射而色散。

色散了的光被聚焦在一个微微弯曲并带有出射狭缝的表面上，移动棱镜或移动出射狭缝的位置，就可使所需波长的光通过狭缝照射到试液上。

图棱镜单色器的示意图
3、吸收池(比色皿)
比色皿，用于盛吸收试液，能透过所需光谱范围内的光线。

在可见光区测定，可用无色透明、能耐腐蚀的玻璃比色皿，大多数仪器都配有液层厚度为0.5、1、2.5cm 等的一套长方形或圆柱形比色皿。

同样厚度比色皿之间的透光率相差应小
4、检测系统
检测系统测量吸光度时，并非直接测量透过吸收池的光强度，而是将光强度转换成电流进行测量，这种光电转换器件称为检测器。

因此，要求检测器对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，最重要的是产生的光电流应与照射于检测
器上的光强度成正比。

光电比色计及可见光分光光度计常使用硒光电池或光电管作检测器，采用检流计作读数装置，两者组成检测系统。

图光电管监测器示意图
通常使用悬镜式光点反射检流计测量产生的光电流，其灵敏度一般为10-9A/格。

目视比色法
用眼睛比较溶液颜色的深浅以测定物质含量的方法，称为目视比色法。

目视比色法特点：
1)目视比色法的主要缺点是准确度不高，如果待测液中存在第二种有色物质，
甚至会无法进行测定。

2)由于许多有色溶液颜色不稳定，标准系列不能久存，经常需在测定时配制，
比较麻烦。

3)但设备简单，操作简便，比色管内液层厚使观察颜色的灵敏度较高，且不要
求有色溶液严格服从比耳定律，因而它广泛应用于准确度要求不高的常规分析中。

7.4 可见分光光度法
一、显色反应及其条件的选择
㈠显色反应和显色剂
在分光光度分析中，很少利用金属水合离子本身的颜色进行光度分析，因为它们的吸光系数值都很小。

一般都是选适当的试剂，首先利用显色反应把待测组分转变为有色化合物，然后进行测定。

将待测组分转变为有色化合物的反应叫显色反应，与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。

对显色反应的要求：
①应有较高的灵敏度与选择性；
②形成的有色配合物应组成恒定、性质稳定；
③显色条件易于控制；
④有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大。

显色剂主要分为无机显色剂和有机显色剂两大类：
1. 无机显色剂
无机显色剂在比色分析中应用得并不很多，主要原因是生成的络合物不够稳定；灵敏度和选择性也不高。

目前应用较多的主要有硫氰酸盐（测定Fe、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)、Nb等），钼酸铵（测定Si、P、W等和过氧化氢（测定Ti(Ⅳ)）。

2. 有机显色剂
大多数有机显色剂与金属离子生成极其稳定的螯合物，而且具有特征的颜色，因此，选择性和灵敏度都较高。

不少螯合物易溶于有机溶剂，可以进行萃取比色，这对进一步提高灵敏度和选择性很有利。

有机显色剂大多是含有生色团和助色团的化合物。

在有机化合物分子中，一些含有不饱和键的基团，它们能吸收大于200nm波长的光，这种基团称为广义的生色团。

某些含有孤对电子的基团，它们与生色团上的不饱和键相互作用，可以影响有机化合物对光的吸收，使颜色加深，这些基团称为助色团。

有机显色剂的种类极其繁多，简单介绍了几种：
⑴邻二氮菲
属于NN 型螯合显色剂，是目前测定Fe 2+较好的试剂。

⑵ 双硫腙（即二苯硫腙）
属于含S 的显色剂，是分光光度分析中最重要的显色剂，是目前萃取比色测定Cu 2+、Pb 2+、Zn 2+、Cd 2+、Hg 2+等很多重金属离子的重要试剂。

⑶ 二甲酚橙（缩写为XO ，结构式三师P.325）
二甲酚橙属三苯甲烷显色剂，是配位滴定中常用的指示剂，也是光度分析中良好的显色剂。

在酸性溶液中能与多种金属离子生成红色或紫红色的配合物。

⑷ 偶氮胂Ⅲ（又称为铀试剂Ⅲ）
属偶氮类螯合显色剂。

它可以在强酸性溶液中，与Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)、U(Ⅳ)
等生成特别稳定的有色络合物。

在此酸度下金属离子的水解现象可不考虑，因而简化了操作手续，提高了测定结果的重现性和可靠性。

目前偶氮胂Ⅲ已广泛用于矿石中铀、钍、锆以及钢铁和各种合金中稀土元素的测定。

⑸ 铬天蓝S （也称铬天菁S ，简称为CAS ） 属于三苯甲烷类螯合显色剂，是测量铝的很好试剂。

㈡ 影响显色反应的因素 1. 显色剂用量
生成有色配合物的显色反应一般可用下式表示：
M + nR MRn
（被测组分） （显色剂） （有色化合物） 或
对稳定性较高的配合物，只要加入稍过量的试剂，显色反应即能定量进行。

对于有些显色反应,显色剂如果加入太多，有时反而会引起副反应，对测定不利。

必须严格控制试剂的用量。

例如：以SCN -作显色剂测定钼时，是要求生成红色的Mo(SCN)5 配合物，当SCN -浓度过高时，可生成浅红色的Mo(SCN)6-配合物，反而使其吸光度降低。

n n
β[M][R][MRn]=n
n [R]β[M][MRn]⋅=
Mo(SCN)32+ Mo(SCN)5 Mo(SCN)6-
(浅红) (橙红) (浅红)
而以SCN -作显色剂测定Fe 3+时，随SCN -浓度增大，逐步生成颜色更深的不同配位数的配合物，使吸光度值增大。

对上述两种情况，就必须严格控制显色剂的用量，才能得到准确的结果。

在实际工作中，通常根据实验结果来确定显色剂的用量。

通常有下列三种情况：
⑴ 该曲线较常见。

⑵ 该曲线与第一种曲线不同的地方是曲线的平坦区域较窄。

⑶ 该曲线与前两种情况完全不同。

2. 溶液的酸度
酸度对显色反应的影响主要有以下几方面： ⑴ 影响显色剂的浓度和颜色
Me + + HR MeR + H +
⑵ 影响被测金属离子的存在状态
Al(H 2O)63+ Al(H 2O)5OH 2+ + H +
2Al(H 2O)5OH 2+ Al 2(H 2O)6(OH)33+
⑶ 影响配合物的组成
对于某些生成逐级配合物的显色反应，酸度不同，配合物的配位比不同，其色调也不同。

例如：磺基水扬酸与Fe 3+的显色反应，在不同酸度条件下，可能生成1∶1，1∶2，1∶3三种颜色不同的配合物，故测定时应控制溶液的酸度。

3. 显色时间
不同的显色反应颜色达到最大的吸收强度所需时间是不同的，而且保持颜色稳定的时间范围也是不同的。

所以，为了测得准确的结果，应在保持颜色稳定的时间内测定吸光度。

4. 温度的影响
显色反应的进行与温度有很大关系。

一般显色反应可在室温下完成。

但是有
的在室温下进行得很慢，需要加热促使反应迅速完成。

有的显色反应所形成的配合物在温度高时发生分解或褪色。

有的需放置一段时间才能使反应进行完全。

显然，对于不同的显色反应，应选择适宜的温度进行反应，使反应能进行完全。

同样，标样和试样显色时，其温度应很近似，以减小其误差。

5. 溶剂的影响
有机溶剂会降低有色化合物的离解度，从而提高显色反应的灵敏度。

同时，有机溶剂还可能提高显色反应的速度以及影响有色配合物的溶解度和组成。

6. 干扰离子的影响
干扰离子的存在对光度测定的影响大致有以下三种情况：
⑴干扰离子本身有颜色，在被测物所选用的波长附近有明显的光吸收，但不因加入试剂而改变。

⑵干扰离子（不论本身有无颜色）能与显色剂生成有色化合物。

⑶干扰离子阻止被测离子与显色剂的反应，致使显色反应进行不彻底，而产生负干扰。

消除干扰作用一般有以下几种方法：
①控制酸度
②选择适当的掩蔽剂
③利用生成惰性络合物
④选择适当的测量波长
⑤选用适当的参比溶液
⑥分离
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
㈠仪器测量误差
对给定的光度计，透光度与吸光度的读数误差是衡量测定结果的主要因素。

对于一给定的光度计，透光度读数误差△T基本是一常数，约为0.01~0.02。

但是当透光度（T）不同时，同样大小的△T所引起的浓度误差△C是不同的，这可从透光度与浓度的关系图或相对误差与透光度的关系图中可看到。

如：T%=10~20%时（△T=10），△A≈0.3；
T%=80~90%时（△T=10），△A≈0.05。

可以看出，A值越大，△T引起的△A就越大。

当T=0.368时（即A=0.434），测量误差最小。

在T=20~65%（即A=0.2~0.7）范围内，浓度测量的相对误差较小。

透光度T太小或太大，误差会急剧增大。

所以对于光度的测定，尽可能落在透光度为20~65%（即吸光度为0.2~0.7）的这一个范围内，测量才较准确。

㈡测量条件的选择
1. 入射光波长的选择
为了使测定结果有较高的灵敏度，一般情况下，入射光的波长应选择待测溶液有最大吸收的波长。

最大吸收波长原则、吸收最大、干扰最小。

但也要考虑体系的吸收，如下图。

图吸收波长的选择(选择510nm，而不是410nm)
2. 控制适当的吸光度范围
浓度相对误差合透光度误差的关系式：
T T
T C C ∆=∆lg 434
.0 c
c
∆：浓度的相对误差；T ∆：透光度的绝对误差(±0.2%——±2%，假定0.5%) A ：0.15-1.0，%T=70-10，浓度测量误差1.4%-2.2% 。

A=0.434，T=0.368，
c
c
∆极小值1.4％。

假定透光度绝对误差△T 与透光度值无关，是一个常数，△T 被认为是由仪器刻度读数不可靠所引起的误差。

实际上由于仪器设计和制造水平的不同，△T 可能改变。

影响透光度测量误差的因素很多，难以找到误差函数的确切表达式，因而在实际工作中，应参照仪器说明书，创造条件使测定在适宜的吸光度范围内进行。

例如72型分光光度计适宜测定的吸光度范围为0.1-0.65。

根据朗伯一比耳定律，可以改变吸收池厚度或待测液浓度，使吸光度读数处在适宜范围内。

可以控制溶液的浓度使其A 值落在0.2~0.8范围内。

3. 选择适当的参比溶液
①当显色剂及制备试液时所用的其它试剂均为无色，而且被测试液中又无其它有色离子存在时，可用蒸馏水（或纯溶剂）作参比溶液。

②如果显色剂为无色，而被测试液存在其它有色离子时，应采用不加显色剂的被测试液作参比溶液。

③如果显色剂和试剂均有颜色时，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，显色剂及其它试剂均按试液测定方法加入，以作为参比溶液，这样还可以消除一些共存组分的干扰。

选好参比溶液后，可测定一系列标准溶液的吸光度，作出工作曲线，然后测出被测试液的吸光度。

在工作曲线上找到其被测物的浓度。

三、 定量分析 （一）单组分的测定 1. 一般方法
当试液中只有一种被测组分在测量波长处产生吸收时，一般采用标准曲线法进行测定。

如：⑴微量铁的测定：
⑵磷的测定：
2. 示差分光光度法
吸光光度法一般只适宜于微量组分的测定。

当用于高含量组分测定时，既使没有偏离朗伯-比耳定律的现象，但吸光度超出了准确测量的读数范围，也会引起很大的误差。

采用示差分光光度法就可克服这一缺点。

用标准溶液代替空白溶液来调节仪器的100%透光度或0%透光度，以提高方法的准确度。

这种方法称为示差分光光度法，简称示差法。

目前有浓溶液示差法、稀溶液示差法和使用两个参比溶液的示差法，其中以浓溶液示差法应用最多。

（1）高浓度试样的测定（即高含量组分的测定）
设有浓度为C
1和C
2
的有色溶液，按普通分光光度法，用无色空白溶液（C
）
作参比溶液，得
A
1 = κ·b·c
1
⑴
A
2 = κ·b·c
2
⑵
⑵- ⑴式得：
△A=A
2 - A
1
=κ·b（C
2
- C
1
）=κ·b·△C
当b一定时，△A=κ′·△C
从该式可知，被测试液与参比溶液的吸光度差值，与两溶液的浓度差成正比。

这就是示差法的基本原理。

（2）低浓度试样的测定
先用空白溶液调节仪器的透光度为100%，再用一个浓度比试液稍高（即透光度比试液透光度稍低）的标准溶液调节透光度为0%，然后测量待测试液的透光度。

（3）浓度适中的试样的测定
测定浓度适中的试样，如果希望得到更加准确的读数，则可选择两个组分相同、浓度不同的溶液作参比溶液，试液浓度应介于此两种溶液的浓度之间。

调节仪器，使浓度大的参比溶液的透光率为0%，浓度小的参比溶液的透光度为100%，测一系列标准溶液的吸光度，作工作曲线，并测定试液的透光度。

从工作曲线上。