一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810613517.6
(22)申请日 2018.06.14
(71)申请人 东北农业大学
地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区长
江路600号
(72)发明人 谢凤英　崔梦晗　陈晓旭　王宇琦　
韩雪　
(51)Int.Cl.
C07D 311/62(2006.01)
G01N 1/28(2006.01)
G01N 1/34(2006.01)
G01N 1/42(2006.01)
G01N 21/35(2014.01)
G01N 21/3563(2014.01)
(54)发明名称
一种黑米原花青素提取及其基本结构单元
检测的方法
(57)摘要
本发明公开了一种黑米原花青素提取及其
基本结构单元检测的方法。

包括原料预处理、提
取、过滤、脱溶、干燥、膜过滤、大孔树脂分离纯
化、冷冻干燥和红外光谱法分析等步骤。

本发明
利用超微粉碎技术在物料颗粒几何尺寸变化时
伴随着物理和化学变化以及有机溶剂丙酮的双
水溶性，破坏原花青素与黑米大分子成分蛋白
质、纤维素分子间氢键作用力实现原花青素分子
的释放。

利用膜过滤与大孔树脂吸附相结合分离
纯化方法进行原花青素物质的富集，通过红外光
谱图谱和二阶导数谱图比较分析技术建立黑米
原花青素基本结构单元的检测方法。

本发明提取
的黑米原花青素生物活性好，检测方法快捷、准
确、
高效。

权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 108675979 A 2018.10.19
C N 108675979
A
1.一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：首先将原料黑米进行低温干燥，其后进行粉碎获得黑米超微粉；
(2)有机溶剂提取：将70％丙酮溶液加入所得到的黑米超微粉中进行震荡提取，得到黑米原花青素提取液；
(3)脱溶干燥：黑米原花青素提取液经抽滤得到滤液，其后采用旋转蒸发的方式除去滤液中丙酮溶液得到黑米原花青素粗提取液，真空干燥成黑米原花青素粗提取粉末；
(4)膜过滤：称取一定量的黑米原花青素粗提粉末于乙醇溶液中溶解，混匀，将此膜过滤原液经滤膜微滤后，收集流出液备用；
(5)大孔树脂分离纯化：首先对膜过滤后的流出液采用AB -8大孔树脂进行吸附，水洗除杂，然后利用乙醇溶液进行洗脱处理，得到黑米原花青素纯化物；
(6)冷冻干燥：将高纯度原花青素浓缩液于真空冷冻干燥箱中进行干燥，设置真空度为0.1Mpa，干燥后即得高纯度黑米原花青素粉末。

(7)红外光谱结构检测：取2.0mg黑米原花青素，加入200mg KBr混匀后研磨，压片后进行红外光谱分析。

2.根据权利要求1所述的一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，其特征在于，步骤(1)中低温干燥温度为60℃，粉碎后超微粉达到100～200目。

3.根据权利要求1所述的一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，其特征在于，步骤(2)中提取固液比为1：15，温度为25℃，每次提取30min，提取2次。

4.根据权利要求1所述的一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，其特征在于，,步骤(3)中原花青素浓缩丙酮回收采用减压浓缩方法，其温度为50～60℃，压力为0～0.09Mpa。

5.根据权利要求1所述的一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，其特征在于，步骤(4)中膜过滤原液质量分数为5g/L，滤膜直径为0.45μm。

6.根据权利要求1所述的一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，其特征在于，步骤(5)吸附条件为：处理后树脂为中性，吸附时间为3.0h，吸附温度为30℃，上样流速为2～4BV/h，质量浓度为80％的乙醇溶液进行洗脱。

7.根据权利要求1所述的一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，其特征在于，步骤(6)中真空度为0.1Mpa，干燥温度为30～70℃。

8.根据权利要求1所述的一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，其特征在于，步骤(7)中通过红外光谱图谱和二阶导数谱图比较分析技术建立黑米原花青素基本结构单元检测的方法，其特征在于，通过特定振动频率区所存在的特征吸收峰的个数来判断B环上羟基的数量变化，进而确定原花青素的基本结构单元归属，实现原花青素结构的快速鉴别。

权　利　要　求　书1/1页CN 108675979 A
一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法
技术领域
[0001]一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，属于植物材料中原花青素提取纯化及其基本结构单元检测的技术领域。

具体涉及到超微粉碎技术、膜过滤技术和红外光谱分析技术，本发明利用膜过滤与大孔树脂吸附相结合分离纯化方法进行原花青素的富集，通过红外光谱图谱和二阶导数谱图比较分析技术建立黑米原花青素基本结构单元的检测方法。

提取的黑米原花青素生物活性好，检测方法快捷、准确、高效。

背景技术
[0002]原花青素(也称缩合单宁)是自然界中广泛存在的天然多酚类物质，主要存在于植物的皮、壳、籽、核、花和叶中。

原花青素是目前国际上公认的清除人体内自由基效果最好的天然抗氧化剂，其具有良好的抗癌、抗炎、调节血压、保护视力和软化血管等作用。

近年来，从植物中提取的原花青素作为功能性因子广泛应用于保健食品加工中，而原花青素基本结构单元的组成模式是其保健功能发挥的物质基础。

原花青素的基本结构多为黄烷-3-醇类的化学低聚物或聚合物，因其聚合度和组成单元的不同而存在着多种同分异构体。

因此，对原花青素基本结构单元快速检测就具有一定的现实意义。

[0003]植物中的原花青素主要分布在植物细胞的液泡中，由于细胞壁的保护需先进行破壁处理才可进行有效的提取。

超微粉碎技术利用机械力在改变物料几何尺寸的同时利用伴随着的复杂物理、化学变化过程促使物料淀粉粒内部充满了晶格变形、其纳米晶微单元断裂在其外表面产生不饱和价键，高表面能聚集化学活动性会明显增强，特别是有色的粮食品种(例如黑米)，其本身所带的花色苷等功能性因子在物料颗粒较大时很难发挥其自身应有保健功效，或者某一种物质在未经处理时难以得到有效的转化，这就使得其在利用途径上受到很大的限制。

超微粉碎在原料预处理上恰能满足这一要求，它在改变物料状态的同时，对物料一些特定的功能性成分加以改变，可有效提高功能性因子的保健功能性。

[0004]黑米因其糙米(颖果)的果皮和种皮内含有大量天然花色苷类化合物而得名。

黑米中含有的花青素和原花青素等生物类黄酮物质的提取方法主要有水提取法、有机溶剂提取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法和超临界CO2萃取法。

其中有机溶剂提取为传统的提取方法，针对其缺点本发明提出超微粉碎辅助双水溶性有机溶剂丙酮提取的模式进而促进黑米原花青素通过化学键的结合直接溶解于有机溶剂中，有效保护原花青素的生物活性，提高提取效率，其生产设备简便，易于推广。

例如，CN107602521A“一种火龙果皮提取原花青素的方法及制得的原花青素与用途”中采用超声波辅助提取技术，利用超声波的热效应、空化技术、加快了细胞壁的破碎促使细胞外溶剂进入细胞内部，从而利于细胞内部物质的溶出，但在提取过程中花青素因受热而导致降解，降低其生物活性；例如，CN106381319A“一种葡萄籽原花青素低聚体高效提取分离方法”中采用酶辅助提取，先利用纤维素酶、β-葡萄糖苷酶对脱脂葡萄籽粉进行前处理，再利用乙醇溶液提取，该提取方法成本高，难以推广应用。

本发明纯化方法先采用膜过滤技术去除淀粉、蛋白质、脂质等大分子物质，为后续纯化富集提供有利条件，再利用大孔吸附技术吸附低聚原花青素，进一步提高萃取纯化效率，减
少大分子杂质对大孔吸附的干扰，提高资源利用率。

例如，CN102766125A“一种黑米花青素的提取纯化方法”中将提取液只通过D101大孔树脂吸附纯化，而后进行脱乙醇处理，该方法未针对纯化效率进行提升，粗提取液中大分子物质在吸附过程中将使大孔树脂因吸附而堵塞，原花青素的富集率会有所降低。

[0005]原花青素结构的鉴定方法目前主要有分光光度法和高效液相色谱法。

分光光度法是利用原花青素降解产生的红色原花青素在564nm处有最大吸收来进行原花青素类化合物的测定。

该方法因对照品纯度问题，无法精确鉴定原花青素的结构类型，其准确度较低适用于原花青素的定量分析。

而高效液相色谱法是利用HPLC色谱柱将原花青素各组分分离，再用标准品进行定量。

该方法即可定量也可定性分析，但其仅限于原花青素单体及低聚体分析，而对于以立体异构体形式存在且聚合体和同聚异构体之间极性相近的原花青素，无法实现其分离和结构的鉴定。

鉴于此，利用红外光谱技术(FTIR)在混合体系中每个基团都有自己特定的红外特征吸收峰，同一种官能团在不同的化合物中的吸收强度和波形会出现在一个特定的波数范围内，官能团间相互叠加，从而构成了一个波数分布极为清晰的红外光图谱体系，即可通过特定振动频率区所存在的特征吸收峰的个数来判断B环上羟基的数量变化，进而确定原花青素的基本结构单元归属，实现原花青素结构的快速鉴别。

此方法在原花青素基本结构单元鉴定中具有高度特征性、取样量小、简便快捷等特点。

发明内容
[0006]针对上述问题，本发明提供一种生产成本低、生物活性好、检测方法快捷、准确、高效的黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法。

[0007]技术方案：一种黑米原花青素提取及其基本结构单元检测的方法，它包括以下步骤：
[0008](1)原料预处理：首先将原料黑米进行低温干燥，其后进行粉碎获得黑米超微粉；[0009](2)有机溶剂提取：将70％丙酮溶液加入所得到的黑米超微粉中进行震荡提取，得到黑米原花青素提取液；
[0010](3)脱溶干燥：黑米原花青素提取液经抽滤得到滤液，其后采用旋转蒸发的方式除去滤液中丙酮溶液得到黑米原花青素粗提取液，真空干燥成黑米原花青素粗提取粉末；[0011](4)膜过滤：称取一定量的黑米原花青素粗提粉末于乙醇溶液中溶解，混匀，将此原液经滤膜微滤后，收集流出液备用；
[0012](5)大孔树脂分离纯化：首先对膜过滤后的流出液采用AB-8大孔树脂进行吸附，水洗除杂，然后利用乙醇溶液进行洗脱处理，得到黑米原花青素纯化物。

[0013](6)冷冻干燥：将高纯度原花青素浓缩液于真空冷冻干燥箱中进行干燥，设置真空度为0.1Mpa，干燥后即得高纯度黑米原花青素粉末。

[0014](7)红外光谱结构检测：取2.0mg黑米原花青素，加入200mg KBr混匀后研磨，压片后进行红外光谱分析。

[0015]所述步骤(1)中低温干燥温度为60℃，粉碎后超微粉达到100～200目。

[0016]所述步骤(2)中提取固液比为1：15，温度为25℃，每次提取30min，提取2次。

[0017]所述步骤(3)原花青素浓缩丙酮回收采用减压浓缩方法，其温度为50～60℃，压力为0～0.09Mpa。

[0018]所述步骤(4)膜过滤原液质量分数为5g/L，滤膜直径为0.45μm。

[0019]所述步骤(5)中大孔树脂为非极性树脂，在使用前需进行预处理，具体要求为将树脂置于无水乙醇中浸泡24h，抽滤，蒸馏水洗涤后依次于50g/L HCI溶液和50g/L NaOH溶液中浸泡30min，抽滤，蒸馏水洗涤至中性，烘干待用。

吸附条件为：预处理后树脂pH为中性，吸附时间为3h，吸附温度为30℃，上样流速为2～4BV/h，质量浓度为80％的乙醇溶液进行洗脱。

[0020]所述步骤(6)中真空度为0.1Mpa，干燥温度为30～70℃。

[0021]所述步骤(7)中红外光谱分析条件：测量光谱范围4000～10000cm-1；扫描次数为64；分辨率为8cm-1；增益为2倍；数据形式为log(1/R)。

[0022]本发明具有以下有益效果：
[0023](1)原花青素存在于植物细胞内，由于细胞壁的保护及与细胞内其他有机物形成共轭体系，其提取率一般都较低。

本发明利用超微粉碎技术对黑米进行破壁处理，改变物料的尺寸大小，破坏植物细胞壁，并选取双溶性溶剂丙酮为提取溶剂，可实现有效物质自由进出，释放黑米液泡中的原花青素，提取速度快，操作简单，不仅可以大幅提升花青素的提取率，而且工艺过程中均在非热条件下进行，可有效保护原花青素结构不被破坏，提高其生物利用度。

[0024](2)利用丙酮溶液双水溶性可使原花青素充分溶解，防止其与非极性物质结合，实现原花青素的生物活性的有效保护；再通过膜过滤-大孔树脂吸附方法，有效分离出黑米花青素粗提取液中的多糖、淀粉、脂类等大分子物质，使原花青素得到富集，从而进一步提高其纯度。

[0025](3)采用红外光谱技术利用红外光谱图和二阶导数谱图对黑米原花青素基本结构单元进行比较分析，通过峰区指认各谱带的归属并结合指纹区的有关谱带，确定基本单元类型，整个过程无需考虑试样中原花青素所含有的多聚物的类型和聚合度，即简便、快捷又具有一定的特征性。

[0026](4)未经纯化处理的黑米原花青素的谱图，除了用于黑米原花青素本身基本结构单元的检测外，还可用于与纯化后黑米原花青素的谱图进行对比，从而验证红外光谱技术判断基本结构单元的准确性，操作步骤少，分析方法快速、准确，差异性判断方法容易、明晰。

[0027](5)本发明提取的黑米原花青素生物活性好，检测方法快捷、准确、高效。

适用于以黑米为原料的原花青素提取及其基本结构单元的检测。

附图说明
[0028]图1为实施例1和实施例2中黑米原花青素的红外光谱图
[0029]图2为实施例2中黑米原花青素红外光谱二阶导数谱图
具体实施方式
[0030]实施例1
[0031](1)原料预处理：首先将黑米原料60℃条件下进行低温干燥。

干燥后进行粉碎得到黑米超微粉；
[0032](2)有机溶剂提取：所得到的黑米超微粉利用体积分数为70％丙酮溶液进行震荡提取，提取固液比为1：15，提取温度为25℃，提取时间为30min，提取次数为2次，得到黑米原花青素提取液；
[0033](3)脱溶干燥：黑米原花青素提取液经抽滤得到滤液，其后采用旋转蒸发的方式除去滤液中丙酮溶液得到黑米原花青素粗提取液，真空干燥成黑米原花青素粗提取粉末；[0034](4)冷冻干燥：将高纯度原花青素浓缩液于真空冷冻干燥箱中进行干燥，真空度为0.1Mpa，干燥温度为30～70℃，干燥后即得高纯度黑米原花青素粉末。

[0035](5)红外光谱结构检测：取2.0mg黑米原花青素，加入200mg KBr混匀后研磨，压片进行红外光谱分析。

条件：测量光谱范围4000～10000cm-1；扫描次数为64；分辨率为8cm-1；增益为2倍；数据形式为log(1/R)。

[0036]黑米原花青素的红外光谱图(附图1)中在1601.42cm-1附近有且只有一个吸收峰，在指纹区范围内在780.32cm-1处存在一个强吸收峰，符合原花青定红外光谱吸收峰特征，由此判断黑米原花青素粗提取物基本结构单元为原花青定。

[0037]实施例2
[0038](1)原料预处理：首先将黑米原料60℃条件下进行低温干燥。

干燥后进行粉碎得到黑米超微粉；
[0039](2)有机溶剂提取：所得到的黑米超微粉利用体积分数为70％丙酮溶液进行震荡提取，提取固液比为1：15，提取温度为25℃，提取时间为30min，提取次数为2次，得到黑米原花青素提取液；
[0040](3)脱溶干燥：黑米原花青素提取液经抽滤得到滤液，其后采用旋转蒸发的方式除去滤液中丙酮溶液得到黑米原花青素粗提取液，真空干燥成黑米原花青素粗提取粉末；[0041](4)膜过滤：称取一定量的黑米原花青素粗提物加入50％乙醇溶解为质量分数为5g/L的膜过滤原液，混匀，经直径为0.45μm滤膜微滤后，收集流出液备用；
[0042](5)大孔树脂分离纯化：首先对膜过滤后的流出液采用AB-8大孔树脂进行吸附，水洗除杂，然后利用乙醇溶液进行洗脱处理，得到黑米原花青素纯化物。

大孔树脂为非极性树脂，在使用前需进行预处理，具体要求为将树脂置于无水乙醇中浸泡24h，抽滤，蒸馏水洗涤后依次于50g/L HCI溶液和50g/L NaOH溶液中浸泡30min，抽滤，蒸馏水洗涤至中性，烘干待用。

吸附条件：预处理后树脂pH为中性，吸附时间为3.0h，吸附温度为30℃，上样流速为2～4BV/h，质量浓度为80％的乙醇溶液进行洗脱。

[0043](6)冷冻干燥：将高纯度原花青素浓缩液于真空冷冻干燥箱中进行干燥，真空度为0.1Mpa，干燥温度为30～70℃，干燥后即得高纯度黑米原花青素粉末。

[0044](7)红外光谱结构检测：取2.0mg黑米原花青素，加入200mg KBr混匀后研磨，压片进行红外光谱分析。

条件：测量光谱范围4000～10000cm-1；扫描次数为64；分辨率为8cm-1；增益为2倍；数据形式为log(1/R)。

[0045]黑米原花青素红外光谱图(附图1)中在1596.60cm-1附近有且只有一个吸收峰，在指纹区范围内在783.02cm-1处存在一个强吸收峰，符合原花青定红外光谱吸收峰特征，可判定黑米原花青素基本结构单元为原花青定。

[0046]在二阶导数曲线图(附图2)中，黑米原花青素各阶段波动强度明显减小，尤其在1750～1000cm-1间波动幅度下降最为显著。

其中1750cm-1处为脂类特征峰，1700～1500cm-1
间存在蛋白质酰胺带匹配的特征吸收峰，1300～1000cm-1间为多糖类物质吸收峰，由此可以推测经纯化后的黑米原花青素去除了部分蛋白质、多糖、脂类等大分子物质，这一结果验证本发明方法的准确性。

图1
图2。