细胞培养考试重点整理

第一章绪论
体外培养（IN VITRO CULTURE）：是将活体结构成分（如活体组织、活体细胞或活体器官等）甚或活的个体从体内或其寄生体内取出，模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使之存活和生长发育的方法。

按照体外培养的结构成分，可将体外培养人为分为：
组织培养（tissue culture）指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。

细胞培养（cell culture）指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。

器官培养（organ culture）指从生物体内取出活的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或者器官原基在体外进行培养的方法。

单一化现象组织培养过程中，培养组织不能在体外长期维持其结构和功能，培养的时间长，经过反复传代，细胞出现单一化现象——趋向单一类型的细胞——最终成为细胞培养。

体内培养（IN VIVO CULTURE)：将活体结构成分（如活体组织、活体细胞、活体器官等）甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，放在其他生物体内让其生长和发育的方法。

最常见的体内培养方式就是移植（trans-plantation）。

体外培养技术创立代表性的人或者实验
H ARRISON的工作，较为完善地建立了体外培养活体组织的培养体系，第一次较为系统地观察了体外培养活体组织的结果。

被公认为是体外培养技术的的开始。

标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神经突起是由神经细胞长出的这一重大理论的诞生。

C ARREL对体外培养的贡献：
◆将无菌操作观念引入体外培养过程中。

◆将培养组织包埋技术、营养供应以及继续培养（也称传代或继代培养）等许多重要的培养条件和方法引入盖玻片悬滴培养系统，从而完善了Harrison的方法。

◆发现鸡胚浸液能明显地促进多种细胞的体外生长。

◆设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。

现在一般认为体外培养技术是从Harrison和Carrel真正开始的。

两位美国科学家W.H.L EWIS和M.R.L EWIS最先试用已知成分的合成培养基取代不能准确确定其成分的天然培养基，由于他们和其它许多科学家在此后30多年的努力，最终发展出许多合成培养基。

现代组织培养的三个阶段：
第一阶段悬滴培养
第二阶段单层培养
第三阶段三维培养（立体培养）
现代组织培养的重要标志：
●培养液的改变
●培养容器的改变
●培养方法的改进：液体培养基的应用;单细胞分离培养法
●细胞培养用的多种材料都已商品化、规范化和系列化。

●低温冷冻技术的应用，可将已建立的多种细胞系和细胞株长期冻存。

●细胞培养技术更加广泛地用于生物学和医学研究.
对体外培养技术的评价
●能长时间直接观察活细胞的形态结构和功能活动，是多学科进行科学研究的对象和工具，如细胞学、遗传学、免疫学和肿瘤学等。

●供研究的细胞种类极为广泛，从低等生物到人，或正常组织或肿瘤组织细胞，而且便于记录（通过摄影、闭路电视和摄电影等方式）
●易施加理化因素和生物因素进行实验研究。

如研究某种实验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加入或删除该成分即可。

●可同时方便获得大量细胞类型单一、细胞周期同步、生物学性状基本相同并对实验因素反应一致的细胞群。

●能够进行大规模生物制品的生产。

利用体外培养技术可以大量繁殖动物细胞或微生物以生产生物制品。

●与体内环境相比，体外培养细胞在一定程度上失去了组织联系及相互作用，缺乏在体内时的血运和神经体液调节作用，因此不能将体外实验结果一并推至体内，即不能轻易下结论。

组织培养常用术语
A NCHORAGE-DEPENDENT CELLS OR CULTURES（贴壁依赖性细胞或培养物）：体外培养的细胞只有贴附在不起化学作用的物体的表面时才能生长、生存或维持功能。

A POPTOSIS（细胞凋亡）：是指细胞内死亡程序的启动而导致细胞自杀的过程，因此也常称为程序性细胞死亡（programmed cell death)。

细胞凋亡与机体正常发育、形态形成以及多余细胞的清除等生理过程密切相关，所以被认为是一种积极的生理性死亡。

C ELL CULTURE（细胞培养）：细胞在体外条件下的生长。

C ELL FUSION（细胞融合）：体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使同种或不同种的2个或2个以上体细胞融合产生杂交细胞的过程。

CELL GENERATION TIME（细胞一代时间）：是指单个细胞两次连续分裂的时间间隔。

可借助显微镜电影照相术来精确确定。

CELL LINE（细胞系）：原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系。

C LONE（克隆）：单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。

C ONFLUENCE（汇合）：指在细胞培养瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层，注意与细胞融合的区别。

C ONTACT INHIBITION（接触抑制）：当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞相互接触时，便停止了分裂增殖，相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不再进入S期。

H E L A CELL 来源于子宫颈癌组织（美国黑人妇女Henrietta Lacks）的上皮细胞系，为体外最早建立的人类癌细胞系。

I N VITRO MALIGNANT TRANSFORMATION（体外恶性转化）：细胞在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种于适当的动物，可以产生肿瘤，即异种动物接种致瘤实验。

I N VITRO TRANSFORMATION （体外转化）：细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其他特性的可遗传的变化，但不一定具有致瘤性。

M INIMAL MEDIUM(最低限度培养基)：能满足大多数细胞生长增殖需要的最简单的培养基。

O RGAN CULTURE（器官培养）：是指维持整个器官或器官的一部分在体外生存和生长，并一定程度上保持原来的结构和功能的方法。

P ASSAGE（S UBCULTURE，传代或传代培养）：将细胞从一个培养瓶转移到更多培养瓶的过程。

P RIMARY CULTURE（原代培养）：是指直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。

S ATURATION DENSITY（饱和密度）：在特定条件下，培养容器能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止增殖。

在贴壁培养中以每平方厘米的细胞数表示，而悬浮生长的细胞则以每立方厘米的细胞数表示。

S USPENSION CULTURE（悬浮培养）：细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方法。

T ISSUE CULTURE （组织培养）：组织在体外条件下保存或生长。

借此组织结构或功能得以在体外保持，亦可能在体外维持其分化。

T RANSFECTION （转染）：用生物学的、物理的或化学的方法将目的基因转移到培养细胞内的实验方法。

L IPOFECTIN：一种常用的细胞转染试剂，用该试剂包裹DNA可形成脂质体-DNA复合物，再通过细胞膜融合可将DNA转染入哺乳动物细胞。

C ELL CYCLE：指细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。

分4个时期，即DNA合成期（S期）、有丝分裂期（M期）、有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期（G1期）以及DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期（G2）。

若某种原因细胞不再沿细胞周期运行，而进入休眠状态称为G0期。

细胞株（CELL STRAIN）：是由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特性或标志在尔后的培养中必须保持下去。

恶性转化（MALIGNANT TRANSFORMATION）：不受时间或空间的控制向正常组织侵袭能力的形成，也可导致转移性生长。

群体密度（POPULATION DENSITY）：培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞数，多用细胞数/cm2表示。

S TEM CELL（干细胞）：具有继续增殖与分化潜能的细胞，其中胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC)可形成机体所有各种类型的组织和细胞，甚至发育成一个完整的胚胎，故又称全能性（totipotency）干细胞。

随着细胞分化，这种分化潜能逐渐受到局限，只能分化形成有限细胞类型的细胞称为多能性(multipotency)干细胞，最终成为单能干细胞（Monopotency stem cell )或定向干细胞(directional).
第二章体外细胞培养的基本要求
体外培养的生存条件
一、严格的无污染（无菌无毒）环境
无化学物质污染
无微生物污染
无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（抗体、补体等）
二、合适的生存环境
恒定适宜的温度
●人和动物（哺乳）培养细胞适合温度是35℃～37℃，鸟类细胞温度要求较高，为38.5℃。

●细胞对低温的耐受比高温的耐受强。

●培养细胞置4℃下数小时后，恢复到37℃细胞仍能良好生长。

●低温冷冻技术可长期保存细胞。

气相环境细胞生存所需的气体主要有O2和CO2
●多数细胞缺O2不能生存，但高氧环境对细胞毒性作用较大。

●CO2主要维持培养液的PH，细胞代谢产生的CO2，释放至培养液使培养液变酸。

为维持培养液PH值的恒定，常在培养用液中加入NaHCO3。

●PH 多数细胞适宜的PH为7.2～7.4，细胞耐酸比耐碱强，在偏酸性环境中更有利于生长。

液相环境（渗透压）：指各种平衡盐溶或培养液的等渗状态，细胞必须生活在等渗的环境中，不同细胞的理想渗透压不同。

人血浆渗透压约290mOsm/kg，可视为培养人体的理想渗透压。

对大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260～320mOsm/kg的范围均适宜。

三、合适的营养条件
营养成分：与体内基本相同，主要包括：
1. 氨基酸所有细胞都需要以下12种必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸，这些氨基酸均为Ｌ型。

此外，所有细胞都需要谷氨酰胺，谷氨酰胺在细胞代谢过程中具有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，也是合成磷酸腺苷所需的基本物质。

2. 单糖主要为六碳糖，是细胞代谢的能量来源，也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料，细胞对各种糖的吸收能力不同，葡萄糖最高，半乳糖最低。

3. 无机离子与微量元素：基本元素和微量元素，非培养液固定成分，实验研究中，通常加入不同微量元素，观察对培养细胞的影响。

4. 维生素：在细胞代谢过程中主要扮演辅酶、辅基的作用，必不可少。

●促生长因子及激素：主要来源于血清，对于维持细胞功能、保持细胞状态十分重要。

各种生长因子的作用明显并具有特异性，激素类物质也具有促进细胞生长增殖的作用。

●促细胞贴附物质：体外贴附型细胞在生长过程中，多需要促细胞贴附物质，不同种类的促细胞贴附物质具有不同的促细胞贴附特性。

水和平衡盐溶液
培养用水：体外培养细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。

常用的BSS是H ANKS液和E ARLE液：
◆Hanks：NaHCO3量较少，缓冲能力较弱，宜利用空气平衡。

◆Earle液：含有高浓度NaHCO3，缓冲能力较强，需用5%CO2维持平衡。

注意：配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用无C A 2+、M G 2+的D-H ANKS液血清的种类：
◆牛血清：胎牛血清剖宫产的胎牛
新生牛血清出生24H内
小牛血清出生10-30天
◆人血清、马血清
◆鸡血清、兔和羊血清（同种细胞的特殊培养）
◆单牛血清、混合血清
血清使用中注意的问题：
◆血清中补体成分对某些细胞有毒性作用，应56℃，30 min灭活。

◆血清长期保存应在-20℃以下。

◆分装成小瓶使用，避免反复冻融。

使用浓度：
◆合成培养基不加血清能维持细胞短期生存
◆维持液（2～5%血清）
◆细胞生长液（10～20%血清）
◆不明成分对分析实验结果增加了困难
◆无血清培养基的应用。

体外培养基是根据细胞在体内生存的条件，将细胞体外生长所需物质的种类按一定量严格配制而成。

DMEM（D ULBECCO’S MODIFIED E AGLE’S MEDIUM）：为诺贝尔奖金获得者Dulbecco R.改良的Eagle培养基，多用于哺乳动物与人细胞系的培养。

分为高糖型和低糖型。

RPMI-1640：最初是由Moor等为小鼠白血病细胞培养而设计，开始的配方特别适合悬浮细
胞的生长，主要针对淋巴细胞，经几次改良，从RPMI-1630、RPMI-1634，最后至RPMI-1640。

其组分较为简单，后来发现适用于多种细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细胞、原代细胞或传代培养的细胞，是目前应用最为广泛的培养基之一。

无血清培养基（S ERUM FREE MEDIUM，SFM）：不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。

使用方法：细胞转入无血清培养基需要一个过程，在逐步降低血清的过程中要注意观察是否发生变化，是否有部分细胞发生死亡。

注意观察存活细胞是否保持原有的生物学特性。

细胞在转入无血清培养基培养之前应保存种细胞，按常规培养与含血清培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。

胰蛋白酶溶液P H8.0，37℃时作用能力最强（注意调整pH）。

用D-Hanks液配制，因钙、镁离子可降低其活性。

热消化37℃1h 0.25%冷消化4℃12~20h 0.125%
EDTA溶液（V ERSEN液）配置时应使用用无Ca2+、Mg2+液体溶解，高压蒸汽灭菌，4℃保存。

P H调整液：NaHCO3。

附着底物：细胞贴附在底物上生长的性质呈锚着依赖性。

凡对细胞无毒性的物质都可用作底物。

常用附着底物如下：
（一）玻璃最常用
（二）一次性塑料：
（三）微载体：（由聚苯乙烯或聚丙烯酰氨制成的小球体，附着面大，利于大量繁殖细胞）（四）饲细胞（F EEDER CELLS）：也称滋养细胞，通常成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力，但仍能存活并有代谢活动。

可作为支持物，然后接种上其他细胞，饲细胞的代谢产物利于其他细胞生长，用于某些特殊难培养细胞的培养。

CO2培养箱，可恒定地提供一定浓度的CO2（2%～5%），维持培养液较稳定的pH值，采用N A HCO3-CO2缓冲系统。

应用CO2培养箱须注意：
◆维持一定的CO2浓度
◆保证开放式培养（通气）
◆定期消毒（内置紫外灯、酒精）
◆一定的湿度，避免培养液蒸发
第三章体外培养细胞生物学
体内、外细胞的增殖方式相同，均依赖于有丝分裂，其差异的关键在于细胞的分化，细胞分化是检测细胞差异的核心问题。

细胞离体的变化1．不适应：表现为细胞原有的分化特性减弱或不显。

是因生存条件的改变使分化发生抑制。

2. 去分化或脱分化（Dedifferentiation):即细胞失掉发生分化的能力。

可能是基因变异所致。

3．体外培养细胞具有分化潜能。

很多细胞仍呈现一定程度的分化表达现象。

与体内条件越近似，细胞越易发生分化。

4．细胞离体培养时间越长，分化能力越弱，二者呈反向关系。

5．细胞恶变的本质是细胞增殖和分化调控的失控，诱导癌细胞发生分化是癌细胞逆转的表现。

体外培养细胞的形态学与体内细胞基本相同，形态趋化单一化，依据大体形态可分为：1．悬浮型
2．贴附型
体外培养细胞的增殖能力
体外培养细胞的两大生命特征是分化增殖和生长发育。

1．培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。

2．胚胎细胞>成年组织细胞。

3．高度分化的细胞通常增殖能力较弱。

4．恶性肿瘤细胞可在体外无限传代。

体外培养细胞的生长类型
一、贴附型细胞：1．成纤维细胞型：
2．上皮型细胞：起源于内胚层和外胚层的细胞，体外培养时都可呈现上皮型。

如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等组织。

上皮型细胞的三个形态学特征：呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞紧密相连成单层膜，细胞增殖数量多时，生长时整块膜随之移动；处于上皮膜边缘的细胞多与膜相连，很少脱落细胞群单独活动。

“铺路石样”：细胞紧密排列时，细胞呈多角形或六角形；“拉网现象”（N ETTING）：在构成上皮细胞膜状生长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲，致使上皮细胞膜中形成网眼状空洞。

可能与细胞分泌透明质酸酶有关。

3．游走型细胞：如单核巨噬细胞系统的细胞，如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞以及某些肿瘤细胞属之。

二、悬浮型细胞
传代（PASSAGE）：细胞增殖达到一定密度时，需要分离出部分细胞并更换新营养液，适应细胞的继续生长和增殖，这一过程称为传代。

原代培养期（primary culture）即初代培养，是指从活体内取出组织细胞开始体外培养到第1次进行传代之前的时期，一般持续1～4周。

特点：
1．细胞群是异质性的（heterogeneous），即各细胞的遗传性状互不相同，相互依存性强。

2．细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛，细胞的结构和功能与体内仍很相似。

3．克隆形成率低
4. 多呈二倍体核型。

5. 是检测药物很好的实验对象。

永生性（也称不死性）或恶性性，即细胞获得持久增殖能力，称无限细胞系（Infinite cell line）或连续细胞系（Continuous cell line）。

二倍体细胞系：正常细胞在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，这种细胞称二倍体细胞系（Diploid cell line）。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，是细胞培养工作中的一种习惯说法，与细胞倍增一代的含义不同。

在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。

细胞传“一代”，通常经历三个阶段：
1. 潜伏期(latent phage)：
2. 指数增生期：
3. 停滞期：
指数生长期内细胞分裂相数量（即细胞增殖活性）可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要标志。

一般以细胞分裂指数（M ITOTIC I NDEX，MI）和细胞群体倍增时间表示。

MI即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。

细胞群体倍增时间是指培养物中细胞数量翻倍的平均时间。

一般细胞的M I约为0.1%～0.5%；原代培养物的MI比传代培养物的MI低；连续细胞系和肿瘤细胞的MI较高，可达3%～5%（肿瘤细胞偏高）。

接触抑制（C ONTACT INHIBITION）：正常细胞指数增生期持续3～5天，细胞相互接触能抑制细胞进一步的运动，这种现象称为接触抑制，彼此连接成片，生长面积消失。

而恶性细胞无接触抑制现象，可继续移动和增殖，细胞向三维空间运动，发生细胞堆积（piled up），因此接触抑制可作为区别正常细胞和癌细胞的标志之一。

密度抑制（D ENSITY INHIBITION）：细胞发生接触抑制后，只要营养充分，仍能进行增殖分裂，但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。

永生化和恶变(IMMORTALIZATION AND MALIGNANCY)：前者也称不死性，是细胞获得体外持续生长增殖能力的特性，可恶变；后者指细胞不仅能无限增殖生长，而且具有异体接种致瘤性。

两者是细胞两种不同的性状。

群体依赖性(PD，P OPULATION D EPENDENCE)单个细胞不是细胞永久存在的形式，不能长期生存。

一个有活力的细胞终需经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养细胞的基本存在形式。

单个细胞虽能生长繁殖，但不如群体细胞生存能力强，细胞量多时比少时易于培养，说明细胞之间能相互沟通信息，呈现着相互依存性或群体依赖性。

（正常细胞群PD比转化细胞大，转化细胞和恶性细胞PD小，即PD与细胞恶性成反比关系，恶性细胞独立生存能力增大。

）
提高细胞在体外培养的成功率的关键在于初代培养。

影响培养成功的因素：
一、供体年龄
1．成活率，胚胎>幼年>成年。

2．同一个体的组织，分化低的组织细胞>高分化的组织细胞。

3．组织细胞的异质性，个别细胞优势生长
4．干细胞>非干细胞。

二、培养条件
1．不同细胞对培养基需求不同，应选择相应的培养基，尤其是正常细胞。

2．无限细胞系和肿瘤细胞系适应性强，可在各种培养基中生存。

三、贴附底物
1．贴附细胞：贴附是细胞增殖生长的条件，只有细胞贴附到底物上才能增殖，初
代培养尤为重要。

不同细胞对附着底物要求不同。

2．一旦成为细胞系后，多能顺利贴壁。

（特殊细胞培养，如：神经元→鼠尾胶原处理，乳腺上皮、大肠上皮细胞→饲细胞）四、培养方法（酶的应用）
不同消化分散组织的方法对细胞的贴壁和生长增殖有影响，胶原纤维多的组织用胶原酶消化，上皮细胞适用胰蛋白酶消化。

选择适宜消化法和培养法是培养成功不可忽视的条件。

已鉴定的细胞（C ERTIFIED C ELLS）各种已被命名Cell line和经过细胞生物学鉴定Cell Strain 具有以下特征：形态均一；生长增殖稳定；生物学性状清楚，即已鉴定的细胞（Certified Cells），可用于各种实验研究和生产生物制品。

细胞克隆：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞克隆。

NIH3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）：美国国立卫生研究所建立，每3天传代一次，每次接种3×105cells/ml。

高温湿热灭菌以压力蒸汽灭菌最为常用，压力蒸汽灭菌器消毒好的物品应注意烘干。

第五章细胞培养技术
几种组织分离方法1．离心分离法：适用于血液、羊水、胸腹水等细胞的培养。

2．切割分离法：用眼科剪或手术刀。

组织块培养时，剪切成1mm3大小的组织块，
所取组织多为1cm3，注意用Hanks液漂洗。

3．机械分散法：适用于软组织（如脑组织、胚胎及一些肿瘤组织等）
压挤法，用注射器粉碎组织。

不锈钢筛网（1mm、100μm、20μm网眼）
钝物压取法仅适用于处理软组织。

4．消化分散法：在组织剪切成较小体积基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法→最终使被处理的组织分散成细胞团或单个细胞→制成细胞悬液→进一步培养。

细胞容易生长增殖。

根据组织的不同，可选用特定的消化手段。

（1）胰蛋白酶消化法：
Ca2+、Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定的抑制作用，故需用D-H ANKS液配制。

血清可抑制胰蛋白酶的活性，因此细胞传代时，用胰蛋白酶消化细胞后，不必
用Hanks冲洗。

使用浓度0.01%-0.5%，以0.25%最常用，pH8-9
两种消化方法温消化：37℃，1H
冷消化：4℃，12～20H
（2）胶原酶（Collagenase）消化法：
Collagenase是一种由细菌提取出的酶，适用消化纤维组织、癌组织和上皮组织。

消化作用缓和，无需振荡。

(3) EDTA消化法：EDTA消化细胞后，一定要用H ANKS液冲洗干净，血清对其无中和作用，而培养环境中残留的EDTA对细胞生长有不良影响。

Trypsin Collagenase
消化特性适应于消化软组织消化纤维多的组织
使用浓度0.01～0.5% 0.1～0.3mg/ml
消化时间0.5～2h 1～12h
pH 8～9 6.5～7.0
作用强度强烈缓和
细胞影响时间过长有影响无大影响
血清抑活有无
Ca2+和Mg2+有影响无影响
细胞冻存的基本原理
不附加任何条件下，直接冻存细胞时，细胞内外环境的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高，渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等→细胞死亡。

如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前渗出细胞外，避免细胞损伤。

细胞冻存的原则
（1）为保存细胞最大存活率，一般都采用慢冻快融的方法，掌握好冻存速度。

冻存。