茯苓多糖的超高压萃取工艺优化及其在卷烟中的应用

茯苓多糖的超高压萃取工艺优化及其在卷烟中的应用
吕乔;陈长清;孙海峰;畅晓渊
【摘要】[目的]研究超高压提取茯苓多糖的最佳工艺条件.[方法]在单因素试验的基础上,采用正交试验法对茯苓多糖的超高压提取工艺进行优选,选用L9(34)进行正交试验,以茯苓叶多糖的得率和纯度为指标,考察超高压压力、pH、料液比和保压时间对茯苓多糖提取率和纯度的影响.[结果]试验得出,茯苓多糖的最佳提取工艺条件为:压力250 MPa、pH 10、料液比1∶15 g/ml、保压时间12 min,此条件下茯苓多糖提取率为2.64％,纯度为24.61％.在卷烟中的初步应用显示,添加0.6％的茯苓多糖提取物后,能显著增加卷烟香气量和香气质,各香韵间的协调性较好,杂气降低,余味舒适,综合效果相对较好.[结论]同传统方法相比,超高压提取方法得率高,提取时间短,是提取茯苓多糖的适宜方法,研究可为茯苓多糖的工业化生产提供科学依据.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2013(041)016
【总页数】4页(P7304-7306,7309)
【关键词】超高压;萃取;茯苓多糖;工艺优化
【作者】吕乔;陈长清;孙海峰;畅晓渊
【作者单位】湖南农业大学农学院,湖南长沙410128;深圳烟草工业有限责任公司,广东深圳518109;深圳烟草工业有限责任公司,广东深圳518109;深圳烟草工业有限责任公司,广东深圳518109;深圳烟草工业有限责任公司,广东深圳518109【正文语种】中文
【中图分类】S567
茯苓为多孔菌科真菌茯苓［Poria cocos(Schw.)Wolf］的干燥菌核，是常用的传
统中药，其提取物中的茯苓多糖能减轻癌症患者放疗、化疗的不良反应，对肝硬化、慢性迁延性肝炎有较好的疗效［1－2］。

超高压萃取技术的研究，是食品加工中一个崭新的研究领域。

发达国家在这些领域的研究已经非常深入并取得一系列积极的进展，我国由于起步较晚，与发达国家相比，还有一定的差距［3－6］。

目前国内超高压的加工技术，主要应用于食品灭菌、病毒灭活、疫苗制取、蛋白质改性、生化制药及中药有效成分的提取等方面。

与传统萃取技术相比较，该技术可以缩短提取时间、降低能耗、减少杂质成分的溶出，且可避免因热效应引起的有效成分结构变化以及生理活性的降低;同时，超高
压提取是在一个密闭的环境下进行的，无溶剂的挥发，符合绿色环保的要求［2，5，7－9］。

目前对茯苓多糖的研究甚少，笔者研究了压力、pH、料液比和保压时间等超高压
处理工艺条件对茯苓多糖提取率和纯度的影响，旨在探索出超高压技术提取茯苓多糖的最优工艺，为工业化生产提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 材料茯苓，采自云南地区。

主要试剂:葡萄糖，Sigma公司;浓硫酸，中国医
药集团上海化学试剂公司，分析纯;蒽酮，中国医药集团上海化学试剂公司，分析纯;蒸馏水，密理博超纯水。

主要仪器设备:SHZ-C全塑不锈钢高速粉碎机;循环水
式多用真空泵，巩义英峪仪器厂;RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;IOIA-1电热鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂;UV-2100型分光光度计，上海Unic公司;AL204电子天平，梅特勒－托利多仪器有限公司;UHP900x2-Z超高压设备，包头军工厂;超净工作台。

1.2 方法
1.2.1 超高压提取茯苓多糖。

茯苓在60℃下干燥至恒重后，粉碎，过60目筛。

称取茯苓粉末1 kg，按照茯苓∶石油醚=1∶3体积比例，在水浴温度为60℃时进行脱脂，过滤;溶剂挥干后，按茯苓∶乙醇=1∶3体积比，在80℃水浴中加热回流，以除去小分子醇溶物，过滤。

将样品按一定的料液比装入真空包袋中，用真空包装机在真空时间为2 min、中温下热封3 min;卸压后，将超高压提取后的溶液在4 000 r/min下离心10 min，取上清液，按以上操作将残渣重复提取3次，合并上清液;上清液经10%三氯乙酸去除蛋白后冷冻干燥即得最终茯苓多糖产品。

1.2.2 多糖含量的测定。

准确称取于105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品适量，加水完全溶解，使其制成0.1 mg/ml葡萄糖标准品溶液。

取标准品溶液0、0.5 ml置
于试管内，用水分别定容至1 ml，加入蒽酮试剂(0.2%蒽酮的80%硫酸溶液，现
用现配，储存在棕色瓶中)8.0 ml，立即摇匀。

沸水浴加热10 min，使之立刻冷却。

10 min后，在波长200～700 nm范围扫描，确定最大吸收波长为626 nm。

取一定量的葡萄糖粉末，加水溶解制成0.24 mg/ml的葡萄糖储备液，精密吸取
储备液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 ml置试管内，加水至1.0 ml混匀，制成不
同浓度的葡萄糖对照品溶液，编号为 1、2、3、4、5、6。

吸取 6 个对照品溶液各1.0 ml，分别加入现配的蒽酮试剂各8.0 ml。

沸水浴加热10 min，使之立刻冷却。

10 min后，以首管为空白，在626 nm处测定吸光度A，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程 A=112.62C－0.154 23，
R2=0.999 5。

茯苓多糖提取率计算公式如下:
茯苓多糖提取率=(C×V×D)/W×100%
式中，C为根据标准曲线计算出的浓度(μg/ml);V为提取液的体积(ml);D为样品溶液的稀释倍数;W为样品的质量(μg)。

茯苓多糖纯度的计算公式如下:
茯苓多糖纯度=多糖质量/粗多糖样品质量×100%
1.2.3 卷烟样品制备。

按照卷烟国家标准GB506.4－1996，将上述制备的茯苓多
糖提取物，以加料方式施加于某牌号卷烟空白叶组烟丝中;在温度(22±1)℃、相对
湿度(60±1)%条件下平衡24 h后，将烟丝卷制成烟支;再次平衡24 h后，与空白
烟一起进行评价。

2 结果与分析
该研究以茯苓多糖提取率和纯度为考察指标，在其他萃取条件都相同的情况下，单独改变超高压处理的某个因素，进行单因素试验，研究各因素对超高压提取茯苓多糖效果的影响。

然后在单因素试验的基础上，选取对提取效果影响比较显著的因素进行多因素正交试验，优化出超高压处理的最佳工艺参数，并分析各个影响因素对超高压提取效果的交互作用。

单因素试验设定的缺省的超高压处理条件为:压力
250 MPa、pH 9、料液比1∶15 g/ml、保压时间 10 min。

2.1 超高压萃取压力对茯苓多糖提取效果的影响由图1可发现，在压力低于250 MPa时，多糖提取率和纯度提高比较显著，之后趋于平缓。

压力对多糖提取率的
影响主要表现为:加快活性成分多糖的扩散速率及在压差情况下的细胞壁的破坏，
使多糖有效成分更快溶出。

因此，压力增大，多糖成分溶出速度加快较为明显;但是，压力达到250 MPa以后，压力升高，原已被破坏的细胞，其中的多糖成分溶出提高不明显，反而导致一些杂质也被溶出，从而导致多糖纯度下降［6，10］。

因此，选择多糖最佳的提取压力为 250 ～300 MPa。

图1 不同超高压萃取压力下茯苓多糖的提取效果
2.2 超高压萃取pH对茯苓多糖提取效果的影响从图2可见，随着pH的增高，
茯苓多糖提取率增加，但得率反而略有下降。

因此，提取pH在9时比较适宜。

这是由于茯苓多糖带有较多的羟基，呈弱酸性，在pH 9这种碱性条件下溶解度较大。

纯度升高可能是由于碱性的增大抑制了杂质的溶出［6，10］。

图2 不同超高压萃取pH下茯苓多糖的提取效果
2.3 超高压处理时料液比对茯苓多糖提取效果的影响从图3可知，茯苓多糖提取率和纯度随着溶剂量的增加而提高，这是由于溶剂的量增加，细胞内外两侧的浓度差增大，茯苓多糖有效成分溶出更多［10－11］。

当料液比大于1∶15 g/ml时，提取率增加缓慢，趋于平缓。

综合收率和成本考虑，该研究选择料液比的最佳条件1∶15 g/ml。

图3 不同超高压萃取料液比下茯苓多糖的提取效果
2.4 超高压处理时保压时间对茯苓多糖提取效果的影响由图4可知，保压时间在10～20 min内，茯苓多糖的提取率和纯度变化不明显，这是由于提取过程中压力较高，溶剂能够在极短的时间渗透到细胞内部，茯苓多糖溶解快速达到平衡，延长提取时间并不能明显增加茯苓多糖提取率。

因此，选择超高压保压时间应为10 min［12］。

图4 不同超高压萃取保压时间下茯苓多糖的提取效果
2.5 工艺条件正交试验优化根据单因素试验结果，以压力、pH、料液比、保压
时间进行4因素3水平的正交试验。

因素与水平设计见表1，试验结果见表2。

表1 超高压萃取茯苓多糖工艺正交试验因素水平设计水平因素压力(A)MPa pH(B) 料液比(C)g/ml保压时间(D)min 1 200 8 1∶12 8 2 250 9 1∶15 10 3 300
10 1∶18 12
表2 超高压萃取茯苓多糖工艺正交试验结果分析试验号因素纯度A B C D提取率%%1 1 1 1 1 2.09 23.11 2 1 2 2 2 2.37 23.64 3 1 3 3 3 2.34 24.10 4 2 1 2 3 2.31 24.16 5 2 2 3 1 2.49 23.86 6 2 3 1 2 2.28 24.19 7 3 1 3 2 2.17 22.96 8 3 2 1 3 2.33 22.77 9 83 K2提取 7.08 7.19 6.93 6.82 K3提取 6.75 6.87 7.00 6.98 R提取 0.11 0.21 0.10 0.05 K1纯度
70.85 70.23 70.07 70.17 K2纯度 72.21 70.27 71.00 70.79 K3纯度 68.93
71.49 70.92 71.03 R纯度 1.09 0.42 0.31 0.29 3 3 2 1 2.25 23.20 K1提
取 6.80 6.57 6.70 6.
由表2中提取率极差分析可看出，影响超高压萃取茯苓多糖提取率因素的主次顺序B＞A＞C＞D，提取率最大的工艺条件:A2B2C3D3，具体条件为:压力250 MPa、pH 9、料液比1∶18 g/ml、保压时间 12 min。

由表2中纯度极差分析可看出，影响超高压萃取茯苓多糖纯度因素的主次顺序 A ＞B＞C＞D，纯度最大的工艺条件:A2B3C2D3，具体条件为:压力 250 MPa、pH 10、料液比1∶15 g/ml、保压时间 12 min。

综合考虑，得出茯芩多糖的超高压提取最优工艺为压力250 MPa、pH 10、料液比1∶15 g/ml、保压时间 12 min。

2.6 超高压萃取茯苓多糖最优工艺条件验证试验为了更好地考察该优化工艺是否可靠稳定，取茯苓多糖6份，各称取50 g，按照提取的最佳工艺条件进行验证试验，操作方法如上所述，结果见表3。

验证所得茯苓多糖提取率与正交试验所得数据接近，说明该工艺稳定可行。

在该优化条件下进行验证试验，得到茯苓多糖的平均提取率为2.64%，RSD=0.65%;平均纯度为 24.61%，RSD=0.07%，试验重复性良好。

表3 超高压萃取茯苓多糖验证试验 %重复茯苓多糖提取率茯苓多糖纯度1 2.63 24.59 2 2.64 24.61 3 2.62 24.60 4 2.64 24.63 5 2.67 24.61 6 2.65 24.63
2.7 茯苓多糖提取物在卷烟中的应用结果将前述所得制备的茯苓多糖按 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的用量分别按加料方式施加于某品牌卷烟烟丝，其结果分别如表4所示。

表4 茯苓多糖提取物在某牌号卷烟上的应用功效注:+代表该项指标有增加，++代表该项指标有明显增加，+++及以上代表该项指标有显著增加;－代表有负面影响;如为空格则代表该项指标无变化。

用量%评价指标香气量香气质协调性杂气
余味0.2 + +0.4 ++ ++ ++ － +0.6 +++ +++ ++ ++ ++0.8 +++
+++ ++ + +
由表4可知，当在某牌号卷烟中添加0.6%的茯苓多糖提取物后，能显著增加卷烟香气量和香气质，各香韵间的协调性较好，杂气降低，余味舒适，综合效果相对较好。

3 结论
该研究对超高压萃取得到茯苓多糖工艺中的提取压力、pH、料液比、保压时间的
影响因素进行考察优化，结果表明，影响提取率的因素主次顺序依次为:pH、压力、料液比、保压时间，提取率最大的工艺条件为:压力250 MPa、pH 9、料液比
1∶18 g/ml、保压时间12 min;影响茯苓多糖纯度因素的主次顺序依次为压力、pH、料液比、保压时间，纯度最大的工艺条件为:压力 250 MPa、pH 10、料液
比1∶15 g/ml、保压时间 12 min。

在卷烟中的应用证明，茯苓多糖提取物能显
著增加卷烟香气量和香气质，各香韵间的协调性较好，降低杂气，余味舒适，综合效果相对较好。

在最优工艺条件下得到茯苓多糖的平均提取率为2.64%、平均纯
度为24.61%。

未来对超高压萃取得到茯苓多糖的研究应该进一步考察多糖的结构变化，尤其是其指纹成分的变化，并通过考察茯苓多糖的特殊功能性质，为其在各领域的应用提供理论基础。

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