响应面法优化恩拉霉素发酵培养基

响应面法优化恩拉霉素发酵培养基
唐慧慧;杨淑慎;郭伟利;李清黎
【摘要】Plackett-Burman experiment was used to evaluate the optimal level of 8 factors in Streptomyces fungicidious ERS42-101108 Enramycin initial fermentation medium production , results showed that cottonseed meal , gluten meal and KH 2 PO4 had significantly effect on enramycin production .Steepest ascent was used to approach the key factors of the maximum response region , and by central composite design and response surface , optimum fermentation medium was established .Following the above optimization process , fermentation unit Enramycin increased from 8300 u/mL to 10250 u/mL.%通过Plackett－Burman实验对杀真菌链霉菌Streptomyces fungicidious ERS42－101108产恩拉霉素初始发酵培养基中的8个因素的最佳水平进行评价，表明棉籽饼粉、麸质粉和磷酸二氢钾对恩拉霉素产量影响显著。

用最陡爬坡实验逼近关键因素的最大响应区域，通过中心组合实验和和响应面分析，确定了最佳发酵培养基。

经上述优化，恩拉霉素发酵单位从8300 u ／mL提高到10250 u／mL。

【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2016(044)016
【总页数】5页(P68-72)
【关键词】恩拉霉素;响应面;最陡爬坡实验;优化
【作者】唐慧慧;杨淑慎;郭伟利;李清黎
【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100; 天方药业有限
公司，河南驻马店 463000;西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100;
天方药业有限公司，河南驻马店 463000;天方药业有限公司，河南驻马店 463000【正文语种】中文
【中图分类】Q939.97
恩拉霉素(Enramycin) 又名安来霉素和持久霉素，是土壤中分离出来的放线菌Streptomyces fungicidious NO.B-5477发酵产生的多肽类畜用抗生素。

它们通
过与转糖基酶的底物进行结合阻断肽聚糖的延长，从而破坏细胞壁的合成来抑制细菌的生长。

为了使高产菌株充分表达其高产性能，必须找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。

中山大学的马光辉经过单因素优化及正交优化，获得优化的培养基配方M4，发酵合成的恩拉霉素比在M1 中提高了 360%[1]。

响应面法(RSM)是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通
过对函数响应面和等高线的分析,能够精确地研究各因子与响应值之间的关系,寻求
最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法[2]。

该法不但具备试验次数少,周期短、精度高等优点,而且可以建立连续变量曲面模型；同时,对影响试验指标的各因
子水平及其交互作用进行优化和评价,可快速有效地确定多因子系统的最佳条件[3-5]。

RSM已经在食品、医药、生物工程、农业、天然物提取等领域广泛的应用。

本文通过 Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡法和响应面分析对发酵培养基中
主要因素进行筛选和优化，提高恩拉霉素产量，为实现微生物发酵法工业化生产恩拉霉素提供实验依据和合理建议。

1.1 材料
(1)菌种：ERS42-101108(河南天方药业股份有限公司诱变菌种)。

(2)培养基
平板培养基：参见文献[6]；斜面培养基：参见文献[6]；摇瓶种子培养基：参见文献[6]；摇瓶发酵培养基：参见文献[6]。

(3)培养条件：参见文献[6]。

(4)恩拉霉素效价检测：参见文献[6]。

1.2 实验设计
1.2.1 Plackett-Burman 实验设计
根据文献报道，选择初始发酵培养基中的8种成分玉米粉、麦芽糊精、玉米浆、棉籽粉、麸质粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、豆油，分别作为PB实验设计的8个因素,每个因素分别取低水平为单次单因素实验结果的最佳水平，高水平为低水平的1.25倍，分别以1和-1表示，以恩拉霉素的产量为响应值，进行实验设计。

具体实验设计见表1。

1.2.2 最陡爬坡实验
根据Plackett-Burman法筛选出的显著影响因子效应大小设计步长，进行最陡爬坡实验，找出最高恩拉霉素产量的条件区域。

实验设计水平见表4。

1.2.3 中心组合实验
筛选出显著影响因子并确定出大致条件区域后，显著因子为自变量，以恩拉霉素产量为响应值设计20组实验。

每组实验3次重复，进行响应面分析。

1.2.4 响应面分析
使用minitab软件进行响应面设计及分析。

2.1 P-B实验结果分析
利用Minitab对P-B实验数据进行分析，对各个因素的重要性进行研究，并进行了方差分析和响应优化，实验结果如表3所示。

影响恩拉霉素的关键因素为：棉籽饼粉、麸质粉、磷酸二氢钾这三个因素对恩拉霉
素的产量影响最为显著，作为重要因素进行下一步实验。

2.2 最陡爬坡实验结果
通过分析Plackett-Burman实验结果，了解到了对恩拉霉素的产量有正/负促进的因素。

对它们进行的最陡爬坡实验结果如表4所示。

由表4可知：第5组实验的恩拉霉素产量最高。

这说明最优点在第5组实验附近。

故以实验5的条件为响应面实验因素水平的中心点，棉籽饼粉、麸质粉、磷酸二
氢钾的质量分别为8.5 g、55 g和0.06 g，进行下一步研究。

2.3 中心组合实验结果
根据 P-B 实验选择对恩拉霉素有显著影响的因子，采用中心组合设计对这些因素
进行进一步的优化。

综合考虑单因素实验结果，对表结果进行多元线性回归和二项式拟合，恩拉霉素
产量的模拟方程如下：
Y=7742.19+362.88A+151.4B-562.4C-67.9AB-403.28B2-
354.91C2+109.65AB+180.45BC-1.95BC
恩拉霉素产量的估计回归系数，使用未编码单位的数据项，如表5所示。

当P<0.05时，影响因素对响应值影响为差异显著，小于0.001时为差异高度显著，小于0.0001时为差异极显著。

表6表明，失拟项F值为2.28，即方程模型失拟不显著，方差分析的结果表明方
程的总模型及三因素二次项对恩拉霉素的产量影响极其显著。

说明该模型得到的回归方程是差异极显著的，实验设计可靠。

2.4 响应面优化结果
对棉籽饼粉、麸质粉和磷酸二氢钾显著影响恩拉霉素产量的因子采用响应面优化进一步优化。

优化结果如图1～图3所示。

图1可看出，沿A因素(棉籽饼粉)和B因素(麸质粉)向峰值移动时，A因素在取较
大值时响应曲面变陡，等高线密度变大，表明A在取14.2时对响应值Y的影响显著；B因素也是在取55时曲面较陡，等高线密度较大，是对响应值Y的影响显著。

从图2可看出，A因素(棉籽饼粉)和C因(磷酸二氢钾)向峰值方向移动时，C因素
等高线密度明显变小，取磷酸二氢钾小时等高线密度较稀疏，当磷酸二氢钾小于0.06时，响应面变陡，等高线密度变密，表明较低磷酸二氢钾对响应值的影响显著；A因素则取较大值时曲面较陡，等高线密度较密，表明棉籽饼粉取较大值时对恩拉霉素产量影响显著。

从图3看出，B因素(麸质粉)和C因素(磷酸二氢钾)向峰
值方向移动时，磷酸二氢钾在较小值时响应曲面较陡，超过0.06曲面变缓，等高
线密度变疏，表明磷酸二氢钾取较小值时对响应值影响显著；麸质粉为55时，响应曲面明显变陡，等高线密度变大，表明麸质粉取中心点时对响应值的影响显著。

由Minirab软件分析得到最佳恩拉霉素发酵培养基为：棉籽饼粉 14.2 g/L、麸质
粉 55 g/L、磷酸二氢钾0.06 g/L。

按照响应面法优化出的恩拉霉素发酵条件进行
验证实验，在此条件下，恩拉霉素的产量Y=10100 u/mL，与预测实验恩拉霉素
的产量接近。

对比实验结果表明在此条件下恩拉霉素发酵单位从8300 u/mL提高到10250 u/mL。

比优化前恩拉霉素产量提高了23%。

借助Minitab将响应面法应用于恩拉霉素产生菌ERS42-101108的发酵培养基的优化。

分析结果表明：棉籽饼粉、麸质粉、磷酸二氢钾这三个因素对恩拉霉素的产量影响最为显著。

用最陡爬坡实验逼近关键因素的最大响应区域,通过中心组合实
验和验证实验。

确定了最佳发酵培养基为：玉米粉140 g/L，玉米浆1 g/L，麦芽糊精70 g/L，棉籽饼粉14.2 g/L，麸质粉55 g/L，磷酸二氢钾0.06 g/L，硫酸铵5 g/L，豆油20 g/L。

经上述优化过程，恩拉霉素发酵单位从8300 u/mL提高到10250 u/mL，为实现微生物发酵法工业化生产恩拉霉素提供实验依据和合理建议。