柱离心法小量提取质粒DNA及DNA的琼脂糖凝胶电泳

柱离心法小量提取质粒DNA及DNA的琼脂糖凝胶电泳
实验目的和要求：
1、了解质粒DNA的应用，并学习用柱离心法小量提取质粒DNA。

2、掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的方法。

实验原理：
质粒是细菌中独立于染色体之外的较小的环状双链DNA，它通常携带某种药物（如氨苄青霉素，卡那霉素，链霉素，四环素等）的抗性基因，具有独立的复制原点，并且具有较高的拷贝数（从几个到几百个不等）。

柱离心法首先用碱使大肠杆菌裂解，并使其中的DNA（包括质粒及细菌的染色体DNA）全部变性。

再用酸性缓冲液中和，质粒DNA由于分子较小，很快复性，而染色体DNA分子巨大，几乎不能复性，最后和细胞碎片及膜蛋白共沉淀被离心去除，上清液中含有复性的质粒DNA，蛋白质，RNA，并且盐浓度较高。

在这种条件下，质粒DNA能够牢固地结合在离心柱中的吸附基质上，而大多数蛋白质和RNA在离心时被穿过，残留在吸附基质上的少量蛋白质和RNA 可以用漂洗液洗去，最后，吸附在离心柱上的质粒DNA用低离子强度的溶液或水洗脱。

与蛋白质相比，DNA的分子量通常要大得多，必须用孔径较大的琼脂糖凝胶介质进行分离。

在理想的电泳条件下，具有相同构型的DNA的电泳迁移率和它们分子量的对数成线性关系，分子量相同的质粒DNA的电泳迁移率和它们的构型有关，由
快到慢通常为超螺旋，线性，开环和复制中间体（连环体）。

DNA限制性内切酶可以从内部切割环状或线状双链DNA，II型DNA限制性内切酶具有固定的识别位点和切割位点，它们可以在特定位点以特定方式切割质粒DNA，并且产生有固定序列及形状的末端。

因此，它们在重组DNA技术中具有重要作用。

实验材料：
含质粒的大肠杆菌DH5α；LB+Amp培养基（配方参照《分子克隆》，除非特别说明，以下同）；柱离心质粒小量制备试剂盒（博大泰克公司）；质粒DNA （pUC18-G）；电泳用琼脂糖；TAE缓冲液；goldview荧光染料；6×DNA上样buffer；限制性内切酶Eco RI （10 U/μl，G’AATTC）；Hin dIII （10 U/μl，A’AGCTT）；10× buffer R。

实验方法：
1．将带有质粒的大肠杆菌单克隆接种到1.5 ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃振荡培养12～16小时；
2．1.5 ml过夜菌转移至Eppendorf管中，10000 rpm( r/min)离心1 min，用水泵吸干培养基上清液，加入100 μl 溶液I(含RNaseA)，充分混匀；
3．加入150 μl 溶液II，加盖颠倒6-7次使之混匀，室温放置1～2min；
4．加入150 μ l 溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，室温放置5min；
5．用台式高速离心机，12000 rpm离心10min；
6．吸附柱中加入420 μl 结合缓冲液，将步骤5中的上清转移至吸附柱中，盖上
收集管的盖子，混匀，12000 rpm离心1 min；
7．取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600 μl 漂洗液, 静置1 min，12000 rpm离心30 s；
8．重复步骤7一次；
9．取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，12000 rpm离心2 min；
10．吸附柱放入一个新的1.5 ml离心管，在吸附柱的中央加50 μl洗脱缓冲液或TE buffer或水，室温放置3 ~ 5分钟。

盖好盖子12000 rpm 离心1分钟，收集质粒DNA溶液，-20℃冻存备用；
11．在250 ml椎形瓶中称取0.6 g琼脂糖，加60 ml 1× TAE buffer，在微波炉中加热至沸腾且均匀；
12．往胶溶液中加3 μl goldview荧光染料，混匀，室温自然冷却；
13．制胶板两头分别用胶布封好，放置在水平的实验台上，将梳齿架在制胶板的梳齿槽内，待胶溶液冷至～50℃时，把60 ml胶液全部到入制胶板中，室温自然冷却至充分凝固；
14．撕去封制胶板的胶布，将装有凝胶和梳齿的制胶板放入电泳槽中，加1× TAE 至高过凝胶表面加样孔顶端～2 mm，小心拔出梳齿；
15．取5 μl质粒DNA，与1 μl 6× DNA上样buffer混匀后全部加入点样孔，100 V恒压电泳至溴酚蓝指示剂前沿走到凝胶中间（约需1小时）；
16．关闭电泳仪，连制胶板一起取出凝胶，在凝胶成像系统中观察电泳结果并拍照；
实验结果：
实验现象讨论：
1、分析影响琼脂糖电泳迁移率的主要因素：
（1）DNA的分子量：质粒DNA是不同于染色体DNA的一种分子量较小的DNA，因而迁移率较小；
（2）琼脂糖浓度：
上网查得：分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度见下表：
（2）DNA的分子构型：
质粒DNA为环状双链DNA，由实验原理：可知分子量相同的质粒DNA的电泳迁移率和它们的构型有关，质粒DNA的电泳迁移率较小。