GC及GC-MS方法检测肝素钠中溶剂残留杂质研究

GC及GC-MS方法检测肝素钠中溶剂残留杂质研究
张相雷;许卉
【摘要】目的:建立肝素钠中溶剂残留杂质的快速简便检测方法,并对未知杂质进行研究.方法:采用GC外标法对肝素钠中常见杂质进行检测,结合GC-MS进行合理的方法设计对出现的未知杂质做深入研究.结果:杂质各峰均能完全分离,检测限为
0.3μg·mL-1,定量限为1.3μg·mL-1,在1.3~1200μg·mL-1范围内峰面积与浓度呈良好线性关系,准确度回收率为103.9%,中间精密度为3.7%,未知杂质经GC-MS确认为三甲基硅醇.结论:本方法兼顾检测的简便有效性及杂质的准确灵敏检出,对于肝素钠实际生产中溶剂残留的质量控制具有较高的实用价值.
【期刊名称】《北方药学》
【年(卷),期】2017(014)008
【总页数】2页(P2-3)
【关键词】肝素钠;GC-MS溶剂残留;乙醇;三甲基硅醇
【作者】张相雷;许卉
【作者单位】烟台大学药学院烟台 264005;烟台大学药学院烟台 264005
【正文语种】中文
【中图分类】R927
肝素钠作为临床用量最大的抗凝血药物，广泛收载于各国药典，我国是肝素生产和出口大国[1]。

肝素钠的主要成分为高度硫酸化的糖胺聚糖[2]，其生产工艺随着近年来的不断改进，使用的溶剂逐渐集中于对人体相对更安全的乙醇。

《中国药典》
检测方法使用内标物正丙醇进行内标法检测，检测的杂质除乙醇外，还包括乙醛、甲醇和丙酮[3]。

而在实际生产过程中，乙醇使用前进行质量控制，其中含有的乙醛、甲醇量极低，丙酮基本不能检出。

因此在产品的工艺质量研究及半成品检测中采用GC外标法检测乙醇残留量，简便快速，对出现的未知杂质使用相同条件结合GC-MS进行鉴定在肝素钠溶剂残留杂质研究上具有较强实用性，并可作为药典方法的有益补充。

1.1 实验仪器：气相色谱仪Glarus500（PerkinElmer仪器公司）；GC－MS气质联用QP-2010（岛津仪器公司）；电子天平BT125D（赛多利斯科学仪器）；氮
氢空一体机NHA300（北京中惠普分析技术研究所）。

1.2 实验材料：色谱柱：DB-624毛细管柱（安捷伦仪器公司）；三甲基硅醇（阿拉丁试剂）；乙醇、丙酮（天津科密欧）；甲醇（SIGMA）。

2.1 对照溶液：取色谱纯乙醇5.0mL，置100mL容量瓶中，加水溶解，摇匀，定容至刻度，得39400μg·mL-1乙醇贮备溶液（20℃色谱纯乙醇的密度为
0.788g/mL）；取贮备液1.0mL，置100mL容量瓶中，加水溶解，摇匀，定容至刻度，即得394μg·mL-1乙醇对照溶液。

2.2 供试品溶液：取约2.0g供试品，精密称定，置于10mL容量瓶中，加内标溶
液溶解，摇匀，定容至刻度，即得。

2.3 检测过程：开启气相色谱仪，按表1设定色谱条件，称取氯化钠500mg，预
先加入顶空瓶中，精密量取待测溶液3.0mL，迅速压紧瓶盖密封，当仪器稳定后，进行检测，记录峰面积并按外标法进行计算。

3.1 专属性：精密称取40mg正丙醇于500mL的容量瓶中，加水定容至刻度，再分别称取100mg甲醇、100mg乙醇、20mg丙酮于250mL的容量瓶中，取上
述正丙醇溶液定容至刻度，得对照溶液A，精密称取肝素钠供试品约2.0g置于
10mL的容量瓶中，取40μg·mL-1乙醛溶液100μL置于上述10mL容量瓶中，
用上述对照溶液A定容至刻度，摇匀，即得专属性检测溶液；单独进乙醛、甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇溶液各一针，作为峰保留时间对照。

取检测溶液相邻峰的峰宽和保留时间计算得分离度分别为1.9、12.0、6.9、23.5，均＞1.5 能够有效分离。

3.2 检测限LOD：在最灵敏的仪器状态下，测定至少4个空白样品，取每次最大
噪声高，计算平均噪声水平。

按信噪比为3∶1配制乙醇标准溶液，乙醇溶液：取
2μg·mL-1乙醇溶液1.5mL于10mL的容量瓶中，加水定容至刻度（0.3μg·mL-1）。

连续进样3次，取峰高平均值计算得最小检测限为0.3μg·mL-1。

3.3 定量限LOQ：按信噪比乙醇信噪比10∶1配制乙醇标准溶液，取
7880μg·mL-1乙醇溶液0.152mL于1000mL的容量瓶中，加水定容至刻度
（1.2μg·mL-1）。

连续进样3次，取峰高平均值计算得定量限为1.3μg·mL-1。

3.4 线性:在最小定量限LOQ至规定限度的120%之间均匀选择六个不同的浓度点（乙醇的线性范围为LOQ浓度、200μg·mL-1、394μg·mL-1、700μg·mL-1、1000μg·mL-1、1200μg·mL-1），每点测定四次，记录各浓度下的峰面积，进行线性回归，得线性方程y=721.77x-4094.6，相关系数 r=0.998，在 1.3～
1200μg·mL-1峰面积与浓度呈良好线性关系。

3.5 准确度:在溶剂的LOD到对照品的120%范围内选择3个溶液点（对照溶液的80%，对照溶液，对照溶液的120%）；选择一批有代表性的肝素钠样品，定量称样12份，配制成测试样品溶液；在12份测试溶液中选择9份分别定量添加（1）项中3个浓度的对照溶液，每个溶液添加3份，制成验证所需的样品溶液，另外
3份作为空白对照；对每个浓度点计算加标回收率，分别为103.6%、104.1%、104.0%，平均回收率103.9%。

3.6 中间精密度：分别取三个肝素钠供试品单独称样配制测试溶液，按实验方法进行检测。

每个溶液最少测定3次，计算9份溶液中残留溶剂的含量，由具有相同
资质另一分析人员进行实验，总共得18个检测结果，合并计算中间精密度RSD
为3.7%。

3.7 未知杂质研究：样品检测过程中，基线放大后发现保留时间为5.073min出现未知杂质峰，与3.600min处乙醇峰相对保留时间为1.41，见图1：
为了确认未知杂质峰的成分，在相同的检测条件下分别添加浓度为300μg·mL-1有机试剂（乙醛、乙酸、正丙醇、异丙醇、丙酮、丁酮、异丁醇、乙酸乙酯、仲丁醇、叔丁醇）于样品中进行检测，确认保留时间与未知杂质峰是否一致，从而定性确认未知杂质峰的成分。

测得峰保留时间分别为乙醛峰的3.171min、正丙醇
4.822min、异丙醇 3.958min、丙酮 3.956min、丁酮
5.490min、异丁醇
6.306min、乙酸乙酯5.492min、仲丁醇5.531min、叔丁醇4.046min，乙酸的沸点较高，未检出。

以上各峰均不能覆盖未知杂质峰，采用相同的检测条件对肝素钠成品进行气质（GC/MS）检测，由于该未知杂质峰的检出量很小，将样品溶液的配制浓度比客户方法增加四倍，载气流速调整为2.0mL/min,相对于乙醇峰的相对保留时间为1.41处检出未知峰（保留时间1.747min），仪器自动判定杂质峰为三甲基硅醇（92%可信度），其质谱见图2：
由于气质（GC/MS）的自动判定具有一定的误差，不能100%判定为三甲基硅醇（92%的可信度），同时未知物质的判定是一个相对复杂的过程，不能仅凭几次实验下结论，尤其在微量情况下，受各种干扰更大，使用三甲基硅醇试剂进行结果验证，样品中加入三甲基硅醇进行按2项实验方法顶空进样，在5.039min处未知杂质峰被覆盖，峰面积明显较单独顶空进样品增大，但最大峰出现在6.343处，对初步判断产生新的疑问。

为解决此问题，对乙醇加三甲基硅醇及样品中加入三甲基硅醇进行GC－MS检测，仪器自动判定两峰分别为三甲基硅醇（97%可信度）和六甲基二硅氧烷（88%），三甲基硅醇与乙醇峰相对保留时间为1.41。

样品加三甲基硅醇自动判定两峰分别为三甲基硅醇（97%可信度）和六甲基二硅氧烷（88%），三甲基硅醇与乙醇峰相对保留时间为1.41，6.343min处出现色谱峰应
为六甲基二硅氧烷。

查阅相关文献三甲基硅醇的理化性质如下：沸点100℃，其
结构式中Si-OH键中的羟基不稳定，在酸性或碱性作用下，或受热情况下，缩合
脱水，生成六甲基二硅氧烷[4]，与实验结果一致。

4.1 三甲基硅醇来源尚不十分明确，部分溶剂乙醇中可检出，由于其仅为微量存在，毒性小，远低于安全限度，环境中广泛存在，从质量控制角度未做进一步研究。

初步判断乙醇生产过程中与容器接触复杂化学反应可能生成，或产品与乙醇接触过程中微量副反应生成，检测中毛细管柱的聚硅氧烷成分及生产环境也是可能的来源之一。

4.2 GC外标法测肝素钠中的溶剂残留杂质，与药典方法相比受进样条件变化影响，精密度有所降低，但溶液配制及操作步骤更加简单[5]，引入误差更小，其专属性、检测限、定量限、线性、准确度、精密度均能达到要求，更加简便、快速，适用于中间体检测、产品的工艺研究及成品的快速检测。

4.3 采用GC-MS对GC方法中检出的微量未知杂质进行研究，结合合理的方法设计，能够快速准确地对杂质进行鉴别，为类似杂质的研究提供了可借鉴的有效手段。

【相关文献】
[1]李京，王悦，宋玉娟，等.肝素质量评价与研究[J].中国药学杂志，2008，48（16）：1412-1418.
[2]姬胜利，桑青，张正民.肝素钠的来源控制、结构分析以及结构与生物活性关系的研究进展 [J].中国药学杂志，2012，47（9）：660-663.
[3]中国药典 2010 年版.二部[S].2010：366-367.
[4]桑圣凯，胡生祥，付细亮.六甲基硅氧烷中三甲基硅醇含量的定量分析[J].有机硅材料，2011，
25（4）：256-258.
[5]梅雯芳.气相外标法、内标法检测酒类中苯乙醇的比较[J].食品工业，2008，1：74-75.。