实验4 氨基酸的分离鉴定 纸层析法.ppt
氨基酸的分离鉴定纸层析法
氨基酸的分离鉴定纸层析法引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。
因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。
一、纸层析法的原理纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。
在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。
二、纸层析法的步骤1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。
2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。
3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。
4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。
5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。
三、纸层析法的应用1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。
2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。
3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。
四、纸层析法的优缺点纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点：1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。
2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。
3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。
然而，纸层析法也存在一些缺点：1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。
氨基酸的分离鉴定—纸层析法
（7）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表2。
（8）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到15cm时所需要的时间。
（3）规划：带上手套，取宽约10cm、高约15cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2～3 cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见下图。
【实验原理】
纸层析法（paper chromatography）通常用于蛋白质的氨基酸成分的定性和定量。1944年A．J．P．马丁第一次用纸层析分析氨基酸，得到很好的分离效果。到现在为止，纸层析法已经成为定性或定量测定多肽，核酸碱基，糖，有机酸，维生素，抗生素等物质的一种最简单易行的分离分析工具。
层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。其原理是以滤纸为惰性支持物的分配层析，层析溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，由于分配系数不同，结果物质在两相间不断分配而得到分离。
【注意事项】
⑴.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。
⑵.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。
⑶.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。
⑷.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。
氨基酸的分离鉴定--纸层析法
实验一：氨基酸的分离鉴定--纸层析法一、目的:通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理:层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。
层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。
如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。
纸层析属于分配层析法。
分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。
纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。
水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。
当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。
当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。
溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。
在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验原理
• 茚三酮的显色原理 氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时， 氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被 还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨 结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化 合物，称为罗曼紫（Ruhemann's purple）。
实验试剂与仪器
• 试剂 纯净的赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸 8×10E-3mol/L溶液；四种氨基酸混合溶液（每 种浓度与对应纯净溶液一致）；2.5%茚三酮丙 酮溶液；酸性展层剂（正丁醇：88%甲酸：水 =60：17：8）。 • 仪器 钟罩×1、培养皿×1、小烧杯10ml×1、层析 柱×1、小漏斗×1、新华一号滤纸 （14cm×17cm）×1、电吹风、烘箱、毛细管、 订书机，及其他常用仪器。
实验结果及分析
——图像实例
实验结果及分析
——各氨基酸比移值Rf
氨基酸
Rf
赖氨酸
0.2294
天冬氨酸
0.3814
丙氨酸
0.5771
亮（白）氨酸
0.8609
在同一实验条件下，比移值Rf主要取决于分配系数，不同的物质分配 系数不同，也就有不同的Rf 。此外，溶剂的溶质的性质、滤纸的性质、展 层的温度和p H值均会影响比移值Rf。 实验中，Rf值与个人操作及具体实验条件息息相关，存在一定波动， 但总体趋势相同。
• 纸层析 纸层析法属于分配层析，层析滤纸为载体， 流动相是指层析液，在毛细拉力作用下， 层析液能不断由下向上流动。固定相是指 被吸附在滤纸纤维之间的水分。由于纤维 素上的羟基具亲水性使这部分水束缚在纤 维素周围，不易扩散而成为固定相。
实验原理
• 在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用 下，上升流经滤液滴点时，滴点上的氨基 酸就相继融入层析液，随着层析液上升， 并发生在分配，即有一部分色素从层析液 分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分 配系数的不同，那些分配系数大的氨基酸 分子，随层析液向上移动得快，形成的斑 点集中在滤纸的上部；而分配系数小的氨 基酸分子，随层析向上移动得慢，形成的 斑点集中在滤纸的下面。
氨基酸的分离纸层析法
增加实验次数
综合多种方法
通过增加实验次数，可以降低实验误差， 提高分离效果的可靠性。
可以结合其他分离方法如电泳、高效液相 色谱等，以提高氨基酸的分离效果。
05 结论
纸层析法在氨基酸分离中的应用价值
高效分离
纸层析法能够将氨基酸 进行高效分离，具有操 作简便、分离效果好的
优点。
成本低廉
纸层析法所需材料成本 较低，适合大规模分离 操作，降低了生产成本。
定型方法
选择适当的定型方法，如自然晾干、 加热或使用定型剂等，以固定氨基酸 的位置并保持其稳定性。
04 实验结果分析
分离效果的评价
分离度
通过比较不同氨基酸的迁移距离，可以评估分离效果。分 离度越大，说明氨基酸之间的分离越完全。
分辨率
分辨率是评价纸层析分离效果的重要参数，它反映了氨基 酸在层析图谱中的清晰程度。分辨率越高，层析图谱越清 晰。
02 纸层析法的基本原理
纸层析法的分离原理
纸层析法是一种基于不同物质在固定相和流动相之间分配系数差异的分离技术。 在纸层析法中，固定相是纸上的纤维素，流动相是展开剂。当流动相携带待分离 物质通过固定相时，由于分配系数不同，不同物质在固定相和流动相之间发生分 离。
氨基酸在纸层析法中的分离是基于它们的极性、相对分子质量和其它物理化学性 质的差异。极性较弱的氨基酸在流动相中的溶解度较大，移动较快；极性较强的 氨基酸在固定相中的溶解度较大，移动较慢。
疾病诊断和治疗
某些氨基酸的缺乏或过量与某些 疾病有关，检测氨基酸水平有助 于疾病的诊断和治疗。
纸层析法的简介
定义
应用
纸层析法是一种基于滤纸的层析技术， 用于分离和鉴定混合物中的组分。
纸层析法广泛应用于生物、化学和医 学领域，用于分离和鉴定各种化合物， 如氨基酸、糖类、脂类等。
氨基酸纸层析ppt课件
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三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：
谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品
2、仪器：
(1)毛细管 (2)电热吹风机 (3)层析缸 (4)层析滤纸
(5)小型玻璃喷雾器(6)铅笔、直尺等。
3、试剂：
(1)氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、
组氨酸标准品。
(2)溶剂系统：
正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇来自；2023/12/31
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（6）展开方式：
上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂的 液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易 扩散） Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤纸） 用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂 的流动，Rf较小。
（7）样品溶液中杂质：
如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。
实验一
氨基酸纸层析
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一、实验目的：
1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层 析的原理和操作技术；
2、掌握分配层析法； 3、掌握影响分配系数的因素。
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层析技术(chromatography 色谱技术)
一、发展史：
层析分离技术在20世纪初就已得到应用： ➢ 1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不
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溶剂系统： 正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力， 因而其扩散作用降低形成固定相;
流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在 滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。
由于混合液中各种氨基酸的α值不同，所以移
动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到 分离的目的。
氨基酸的分离鉴定纸层析法ppt课件
（4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧
边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。向培养 皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右， 将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端 在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大 烧杯，仍用塑料薄膜密封。当扩展剂上升到A线 时开始计时，每隔一定时间测定一下扩展剂上升 的高度，填入表3-1中。当上升到15～18cm， 取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿 线，迅速用电吹风热风吹干。
（2）规划：带上手套，取宽约 14cm、高约22cm的层析滤 纸一张。在纸的下端距边缘 2cm处轻轻用铅笔划一条平 行于底边的直线A，在直线 上做4个记号，记号之间间隔 2cm，这就是原点的位置。 另在距左边缘1cm处画一条 平行于左边缘的直线B，在B 线上以A、B两线的交点为原 点标明刻度（以厘米为单 位），参见左图。
（3）点样：用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样 品（每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器，以 免交叉污染），点在这四个位置上。挤一滴点一次，同 一位置上需点2～3次，2～3mL/次，每点完一点，立 刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的 直径最大不超过3mm。每人须点4个样，其中3个是已 知样，1个是待测样品。
（8）将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用 过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上 的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验 收，实验报告当场交给老师。
计算
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距
离
记录与计算汇总
扩展剂前沿上升速度
X（min） 0 5 10 15 20 30 40 60 90 … 18
一、实验目的
掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待 测样品的氨基酸成分。
《氨基酸纸层析》课件
02
在使用展开剂时，要确 保其纯度，以免影响实 验结果。
03
点样时要避免产生气泡 ，以免影响展开效果。
04
在展开过程中，要保持 滤纸条的湿润状态，以 免影响实验结果。
安全须知
实验过程中要佩戴实验服和护目 镜，以避免试剂溅到身上或眼睛
中。
对于有毒有害的试剂，要严格按 照操作规程进行使用和处理，以
免造成危害。
点样
用毛细管取适量氨基酸混合物， 轻轻地点在滤纸条的尖端，确保 点样量适中。
展开
将滤纸条放入展开剂中，确保展 开剂能够充分渗透到滤纸纤维中 。在展开过程中，注意保持滤纸 条的湿润状态。
观察和记录
观察展开后的滤纸条上氨基酸的 分布情况，并记录各氨基酸的Rf 值。
实验注意事项
01
确保实验环境干净整洁 ，以避免污染。
未来研究展望
深入研究纸层析的原理和影响因素，提高方法的稳定性 和可靠性。
将纸层析与其他分析方法结合，实现多组分同时分离和 鉴定，提高分析效率。
探索新的展开剂和固定相，提高纸层析的分离效果和分 辨率。
拓展纸层析在生命科学、医学、环境科学等领域的应用 ，为相关研究提供有力支持。
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《氨基酸纸层析》 ppt课件
xx年xx月xx日
• 氨基酸纸层析简介 • 氨基酸纸层析实验准备 • 氨基酸纸层析实验步骤 • 氨基酸纸层析实验结果分析 • 氨基酸纸层析实验结论与展望
目录
01
氨基酸纸层析简介
定义与原理
定义
氨基酸纸层析是一种利用滤纸作 为固定相，通过溶剂的迁移作用 对氨基酸混合物进行分离和鉴定 的方法。
层析缸
滴管 移液管
恒温水浴锅 离心机
实验四 氨基酸纸层析
1.4625～1.4645 乙酸乙酯 1.2725～1.3745
1.4600～1.4300 苯甲醇 1.5385～1.5405
sin N B sin N A 根据折射定律可得：n A sin α = n B sin β
在临界角以内的区域都有光线通过,是明亮的， 在临界角以外的区域没有光线通过，是暗的。在 临界角上正好是“半明半暗”（如图4-2所示）。 目镜上有一个十字交叉线，若十字交叉线与明暗 分界线重合，就表示光线由被测液体进入棱镜时 的入射角正好为90。
7. 将滤纸条两端，用大头针钉在小木框上，吹 干后用喷雾器均匀地喷一层0.2%茚三酮乙醇溶 液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出 三色点，每个色点代表一种氨基酸。 8. 分别测量并计算三种氨基酸的Rf，再根据教 师供给的值确定此三个色点各为何种氨基酸。 9. 留在试管内的酚溶剂切勿弃去，塞紧塞子。
三、实验步骤
（一）纸层析
1．在滤纸条上端边缘约1厘米的中央剪一小 孔。 2．将滤纸条平放于洁净的纸上，在距离滤纸 下端1cm处用铅笔轻画一横线，并在横线的 中央画一直径为2mm的小圆圈。 3．用毛细管吸取氨基酸混合液，在滤纸条下 端的小圆圈内点样。
4. 取干燥大试管，加入被水饱和的酚溶液 10ml，注意勿使溶液沾到试管壁上，将试管 垂直固定于铁架台上。 5. 在距滤纸条下端0.5cm处穿大头针。从滤纸 条上端小孔处穿棉线并左右分开，调节线的 高度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液 0.5cm，注意勿使点样点浸入溶液中，亦勿使 滤纸条接触试管壁。 6. 此时即可看到溶剂向上移动，溶剂升到一 定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶 剂上升的前沿。
液体的折光率不但与结构和入射光的波长有关， 而且也受温度、压力等因素的影响。由于大气的 变化对折光率的测定影响并不显著，所以，通常 表示折光率时只标明入射光线的波长和测定时的 温度。例如，在入射光为钠的黄光(波长为 589.3nm)，测定温度为20℃时，水的折光率为 20 1.3330，表示为 n D = 1．3330。这里n代表折光 率，20代表测定时的温度，D代表钠光。 折光率可以通过折光仪精确地测定出来，常用的 是阿贝(Abble)折射仪。
氨基酸的分离鉴定(纸层析法)
氨基酸的分离（纸层析法）一、实验原理1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。
利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。
操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。
滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。
当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。
由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。
由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
溶质在固定相中的浓度分配系数溶质在流动相中的浓度物质被分离后在滤纸上的移动速率用值表示：原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，值是常数，故可根据值作定性依据。
氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
二、实验器材标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。
三、实验试剂1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：22、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5四、实验操作1、点样量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。
戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。
取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。
在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。
用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。
2、层析与显色将滤纸卷成圆筒形，用钉书针固定成圆筒状，纸的两边不能接触。
实验四 纸层析ppt课件
在用纸层析法分离氨基酸时，由于各种 氨基酸在此二相中的分配系数不同，各有 一定的迁移率。丙氨酸属于非极性中性氨 基酸，易溶于有机溶剂，而谷氨酸属于极 性酸性氨基酸，易溶于水，因此在纸层析 体系中谷氨酸和丙氨酸相比而言，丙氨酸 更易溶于流动相，因此迁移距离远。
本实验用圆盘滤纸进行水平型层析，
层析结束后利用氨基酸与茚三酮共加热，
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为 底物，加肝匀浆保温后，用纸层析 法检查谷氨酸的出现以证明转氨基 作用。
纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物， 滤纸纤维与水亲合力强，吸收20~22 %的 水。而且其中6~7 %的水是以氢键形式与纤 维素的羟基结合，在一般情况下很难脱去， 而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。所 以纸层析是以滤纸纤维结合水作为固定相， 以有机溶剂作为流动相。
实验六 纸层析鉴定 转氨基作用
层析是利用不同物质，不同的理化性
质如吸附力、分子形状、大小、极性、分 配系数的不同而建立起来的技术。所有层 析系统都有两相组成。既固定相和流动相。 固定相既固体物质或是固定于固体物质上 的成分。流动相既可以流动的物质 如：水 或溶液等。混合物要经过此两相与其作用， 最后分离。
4、显色：将上诉滤纸平放在培养皿中，用 喷雾器喷上0.5%茚三酮溶液用热风吹，此 时可见紫色的同心圆斑出现，比较色斑的 位置和色泽的深浅，分析实验结果。
5、【计算】 分别计算各图谱的Rf值。
生成蓝紫色化合物的茚三酮法显色，观察
色斑，判定结果。
3、层析：取直径10cm圆形滤纸一张，用 圆规半径1cm同心圆，通过圆心作相互垂直 的线， 然后半径每次增加0.5cm画同心圆 至滤纸边缘。
在滤纸圆心处打一孔（如铅笔芯大小）另 取同类滤纸约1cm，下一半剪成须状，卷成 圆筒，如灯芯，插入小孔，（勿使突出滤 纸面）。将层析液放入干燥表面皿中，并 将表面皿置于直径10cm培养皿正中，将滤 纸平放在培养皿中，灯芯浸入溶剂中，将 另一个培养皿反盖上，可见溶剂沿芯上升 到滤纸，再向四周扩展，约25分钟后晕染 的边缘距滤纸边缘约1cm时即可取出，用铅 笔标记层析液前沿，用吹风机吹干。
【正式版】纸层析法分离鉴定氨基酸PPT
由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。 点样：用毛细管依次将Lys(赖) 、 Gly(甘) 、 Pro(脯)、Val (缬)、 Leu (亮)和混合样品分别点在这6个位置上，点样点干后再点一次。 待溶剂上升15～20 cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，电吹风吹干。 纸层析法分离鉴定氨基酸 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。 由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。 注意事项：手不能直接接触滤纸； (3) 显色剂：％ (m/V)水合茚三酮正丁醇溶液 。 在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某种物质的Rf 值是常数，因此可作为定性依据。 在层析缸中装入展层剂，其高度约～2cm。 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。 纸层析法分离鉴定氨基酸
纸层析法分离鉴定氨基酸
将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处， 该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂 沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基 酸在两相中不断分配。由于分配系数（Kd） 不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用 比移值（Rf）来表示。 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸 停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与 原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。如图
笔描出溶剂前沿界线，电吹风吹干。 在所一谓定 Rf条，件是下指（在如纸温层度析、中展，层从剂原的点组至成氨、基层酸析停纸留质点量（等又不称变为）层，析某点种）物中质心的距Rf离值（是X常）数与，原因点此至可溶作剂为前定沿性的依距据离。（Y）的比值。
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原点到层析点中心的距离
Rf＝
原点到溶剂前沿的距离
4. Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、PH层 析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
5.上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。
三、仪器、材料和试剂
实验仪器
1．层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗 2．毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱
六、注意事项
1、切勿用手直接接触滤纸和显色剂。 2、点样过程中必须在第一滴样品干后再
点第二滴。 3、使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇பைடு நூலகம்。
七、思考题
1、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 2、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？ 3、滤纸为什么要在层析缸中预先悬空密封饱
和30min？ 4、展开时为什么要调节滤纸使溶剂前沿线平
4.展层 用长颈漏斗，扩展剂的液面需低于点样线1cm。上沿约 1厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。
5．显色 用0.1%茚三酮丙酮溶液均匀浸透，烘箱（65℃）5分 钟或用热风吹干。脯氨酸、羟脯氨酸产生黄色物质外，所有α－ 氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。
五、实验结果与讨论
2. 掌握氨基酸纸上层层析法的操作技术（点 样、平衡、展层、显色、鉴定） .
二、实验原理
1.是分配层析的一种。在纸上水被吸附在纤维素的纤维 之间形成固定相。当有机相沿纸流动经过层析点时， 层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配，溶质 中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可 以彼此分开。
2.氨基酸与茚三酮的显色反应。 3.物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值来表示的。
3．层析滤纸、手套 、透明胶带或针线
实验材料和试剂
1．氨基酸溶液 分别配制0.5%的Lys、Alu、Ile、Met溶液及 它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。
2．显色剂 0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 3．扩展剂（展层剂）
酸溶剂系统：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比），平衡 溶剂与扩展剂相同。每组配制30ml
α＝
物质在溶剂I中的浓度 物质在溶剂II中的浓度
是一种连续抽提法。一种溶剂通常是被结合在固定的
惰性支持物（柱、膜、纸）上的水，另外一相由流动 的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相。
如果某一混全物的各组分在这两相中的分配系数有足 够的差异，它们就可以被分离。
一、实验目的
1.通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原 理及操作方法
实验4 氨基酸的分离鉴定 －纸层析法
层析法（色谱法）
是一种物理的分离方法。固定相与流动相。 吸附层析、离子交换层析、薄层层析、凝胶层析（凝
胶过滤）、亲和层析、分配层析。
分配层析
分配系数：当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡 时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这 种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数。
碱溶剂系统：正丁醇:12%氨水:95%乙醇＝13:3:3（体积比）， 平衡溶剂为12%氨水。
四、操作步骤与方法
溶剂前沿 层析点
原点
溶剂前沿
亮 苯丙 缬 脯 赖
1．将盛有扩展剂10ml的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。
2．戴手套取层析滤纸一张作标记。
3。点样：干后重复点一次，直径最大不超过3mm。缝成筒状， 两边不能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡 约20~30分钟。
行于点样线？ 5、实验结果为什么有时会产生拖尾、相邻氨
基酸分不开等异常现象？