MTT法测定乳酸菌活菌数的研究
乳酸菌活菌数
乳酸菌活菌数乳酸菌活菌数是指在某一产品中存活的乳酸菌的数量。
乳酸菌是一种益生菌，具有很多益处。
乳酸菌活菌数直接影响产品的质量和功效。
本文将探讨乳酸菌活菌数的重要性以及如何保证其活菌数在产品中的稳定性。
乳酸菌是一种对人体有益的菌群，它可以促进肠道健康。
乳酸菌能够抑制有害菌的生长，维持肠道微生态平衡。
此外，乳酸菌还可以增强免疫系统的功能，提高人体抵抗力。
因此，乳酸菌活菌数的高低直接关系到产品的功效和效果。
乳酸菌活菌数的稳定性是产品质量的重要指标。
乳酸菌是一种活性菌种，其活性会随着时间的推移而下降。
因此，在生产过程中，要保证产品中乳酸菌的活菌数尽可能稳定。
为了实现这一目标，生产商需要采取一系列措施来保护乳酸菌的活性，例如控制产品的存储温度、使用合适的包装材料等。
乳酸菌活菌数的高低还与产品的储存时间有关。
乳酸菌在产品中的存活时间一般较短，因此产品的储存时间越长，乳酸菌活菌数就越低。
为了确保产品的质量，消费者在购买产品时需要留意产品的生产日期和保质期。
同时，消费者在使用产品时也要注意适当的保存方式，避免产品在储存过程中乳酸菌活菌数的下降。
乳酸菌活菌数的测试方法有很多种。
其中，最常用的方法是通过培养基培养菌落来计数。
这种方法可以直观地反映乳酸菌的活菌数。
另外，还可以使用分子生物学的方法来检测乳酸菌的活菌数。
这种方法可以检测到乳酸菌的DNA，从而精确计算活菌数。
无论使用哪种方法，都需要严格控制实验条件，确保测试结果的准确性。
乳酸菌活菌数的标准因国家和地区而异。
不同的国家和地区对乳酸菌活菌数都有相关的标准规定。
消费者在购买产品时可以根据这些标准来选择适合自己的产品。
同时，生产商也需要参考这些标准来确保产品的质量。
乳酸菌活菌数是乳酸菌产品质量的重要指标。
乳酸菌能够促进肠道健康，增强免疫系统功能。
为了保证产品质量，生产商需要采取措施来保护乳酸菌的活性。
消费者在购买产品时也要注意产品的生产日期和保质期。
乳酸菌活菌数的测试方法有多种，但都需要严格控制实验条件。
mtt评价法
mtt评价法摘要：1.MTT 评价法简介2.MTT 评价法的应用范围3.MTT 评价法的优缺点4.MTT 评价法在我国的发展正文：一、MTT 评价法简介MTT 评价法，全称为“最小总体培养时间法”（Minimum Total Time Method），是一种用于评估微生物生长速度的实验方法。
该方法通过比较不同条件下微生物生长至某一特定数量所需的最短时间，从而评估不同条件下微生物的生长速度。
这种方法被广泛应用于微生物学、生物技术、环境科学等领域。
二、MTT 评价法的应用范围MTT 评价法主要应用于以下几个方面：1.微生物生长速度的评估：通过比较不同条件下微生物生长至某一特定数量所需的最短时间，可以评估不同条件下微生物的生长速度。
2.抗生素敏感性测试：通过评估抗生素作用下微生物生长速度的变化，可以初步判断抗生素对微生物的敏感性。
3.生物降解能力评估：通过评估微生物降解有机污染物的速度，可以评估微生物的生物降解能力。
4.生物活性物质筛选：通过评估微生物在特定条件下的生长速度，可以筛选出具有潜在生物活性的物质。
三、MTT 评价法的优缺点1.优点：（1）操作简便：MTT 评价法操作简单，实验周期较短，适用于大规模筛选实验。
（2）结果直观：通过比较不同条件下微生物生长至某一特定数量所需的最短时间，结果直观且易于理解。
（3）适用范围广泛：MTT 评价法可用于评估微生物生长速度、抗生素敏感性、生物降解能力等，适用于多个领域。
2.缺点：（1）实验条件要求较高：MTT 评价法需要严格控制实验条件，如温度、湿度、培养基成分等，否则可能导致实验结果偏差。
（2）受主观因素影响较大：MTT 评价法评估结果依赖于实验者的观察和判断，可能存在主观差异。
四、MTT 评价法在我国的发展近年来，我国在MTT 评价法的研究和应用方面取得了显著进展。
利用MTT法检测活细胞数量和结果分析
1）对数生长期细胞 2）受试因素（药物或细胞） 3）Actinomycin D 4）MTT：以PBS配制成5mg/ml，抽虑除菌，避光 保存在4˚C 5）DMSO（二甲基亚砜） 6）96孔板 7）酶联免疫检测仪 8）细胞培养箱
三、实验步骤
1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度， 将待测细胞(L-929)调密度至3×105/ml，含 10% FCS的完全培养基，100l/孔，（边缘 孔用无菌水填充），5%CO2，37℃孵育， 至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）。 2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁过 夜。
MTT法
一、原理
噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细 胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使 外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能 被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫 检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可 间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器
6）96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具 有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基 中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种 现象，边缘孔用无菌水填充并要保证培养箱中的湿度，减 少开关培养箱的次数和时间。 7）注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导 致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。 建议使用连续加样器。 8）没有去掉上清直接加DMSO，沉淀会很难溶解。加 DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸 去，也可在倒之前先用平板离心机离心96孔板，1000r，5 分钟，然后吸掉上清。 9）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种 细胞，而不作为指标检测孔。 10）除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外， 可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱 15分钟溶解结晶。
ldh法和mtt法
ldh法和mtt法一、介绍在细胞实验研究中，细胞增殖和生长的检测是必不可少的。
而常用的细胞增殖和生长检测方法有许多种，其中较为常见的是LDH法和MTT法。
这两种方法都是通过细胞的代谢和细胞的状态来反映细胞的增殖和生长情况的。
二、LDH法LDH法全称为乳酸脱氢酶检测法，是利用乳酸脱氢酶的氧化还原作用来检测细胞增殖和生长的方法。
该方法基于细胞膜通透性的变化，当细胞膜发生损伤或破裂时，细胞内的乳酸脱氢酶会释放到培养基中。
而乳酸脱氢酶检测法就是通过检测培养基中乳酸脱氢酶含量的变化来判断细胞是否发生了损伤或破裂，以此来推测细胞的增殖和生长情况。
三、MTT法MTT法全称为四氮唑盐（3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基-二氮杂烷）法，是利用MTT盐的还原作用来检测细胞增殖和生长的方法。
该方法的原理是将MTT盐加入细胞培养液中，MTT盐通过细胞中的酶反应还原成具有紫色的甲醛样代谢产物。
而这个代谢产物则会在细胞中不断积累，从而使细胞颜色越来越深。
最后，通过检测细胞的颜色深浅来推测细胞的增殖和生长情况。
四、LDH法和MTT法的比较1.优点与缺点LDH法的优点是可以反映细胞的状态和增殖情况，适用于不同种类的细胞；缺点是需要时间较长，对细胞损伤有一定影响。
而MTT法的优点是简单易行，可作为高通量筛选的快速方法；缺点则是对细胞形态和生长状态的要求较高，对于一些较小或幼稚的细胞不适用。
2.应用范围LDH法和MTT法都常用于评估各种细胞因素（如生长因子、激素、细胞毒性物质等）对细胞生长的影响；同时也受到在细胞增殖实验和细胞毒性实验中的广泛应用。
此外，LDH法和MTT法也可应用于肿瘤和炎症等疾病的研究。
3.实验难度和操作技巧LDH法和MTT法均需要一定的实验基础和耐心，但LDH法一般操作难度稍高些。
五、总结细胞增殖和生长检测方法是细胞实验研究中非常重要的组成部分。
LDH法和MTT法是两种常用的检测方法，不仅能反映细胞的增殖和生长情况，也广泛应用于肿瘤和炎症等疾病的研究。
MTT法在细菌活性检测及药敏试验中的应用
ｄ ｔ ｔ ｙｔｅｂｏｈｍｉ ｏｉ ｔｎｍ ｔｏ （ ｅｅ ｅ ｂ ｒｔ ｃ ｄｌ ｉ ｅｈｄ 尸＞００ ） Ｗｈ ｎｃｍ ａｅ ｉ ｅｓｍ ｏｃｎｒｔｎｏ ｔｅｄａ ａｔｒ ’ｏ— ｃｄ ｈ ｒ ｕｏ ．５ ； ｅ ｏ ｐ ｒｄｗｔ ｔ ｅｃｎｅ ｔ ｉ ｆｈ ｅｄｂｃｅ ａ ｐ ｈｈ ａ ａｏ ｉｓ
相比 ， Ｔ Ｍ Ｔ法检测 的活菌吸光度值明显增加 ，检验结果显示差 异均有统 计学意义 （ ０ ０ ） 用 微量 肉汤稀 释法 和 ｔ Ｐ＜ ． ５ ；
Ｍ ｒ Ｔ 法检测 的鲍曼不 动杆菌 对丁胺卡拉霉素和头孢他啶的敏感性均与临床药 敏结果一致 。结论
法一样 ， ｒｒ 可以用 于检测细菌活性和药 敏试验。 ＭＩ 法 Ｔ
ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｏ ａ ｔ ｒ ｎ ｒ ａ ｉ ｇ ｔ ｅ ｏ ｔｃ ｌｄ ｎ ｉ ｆｅ ｅｙ ｇ ｏ ｐ ｄ ｔ ｃｅ ｙ ｔ ｅ ＭＴＩ ｓａ ｒｂ ｏｈ ｍｉｒ ｄ ｌ ｔｏ ｓ ｍ－ ｅ ｔａ ｉ ｆｂ ｃｅ ａ ｉ ｃ ｅ ｓｎ ｈ ｐ ｉａ ｅ ｓｔ ｏ ｖ ｒ ｒ ｕ ｅｅ ｔ ｄ ｂ ｈ ｏ ｉ ｙ ＂ａ ｓ ｙ ｏ ｒ ｔ ｃ ｏ ｉ ｉｎ ａ ｏ ｉ ｕ ｌ
Ｍ Ｔ 和微量 肉汤稀 释法 检测鲍 曼不动杆菌活性以及鲍曼 不动杆 菌对 丁胺卡拉 霉素和头 孢他 啶的敏感性 ， Ｔ 法 对两种 随着细菌浓度 增加 ， 微量 肉
汤稀 释法 和 Ｍ ｒ Ｔ 法检测 的活菌 或死菌 的吸光度值均增加 ， 但用微量 肉汤稀释法 检测的 同一浓度 的活菌和死 菌的 吸 光度 值之间差别不大 ，检验结果显示差异无统计学意 义 （ Ｏ ０ ） 而 与用 Ｍ Ｙ 检测 的同一浓 度死菌 吸光度 值 ｔ Ｐ＞ ．５ ； Ｔ 法
主国医堂剑逝
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mtt实验报告
mtt实验报告MTT实验报告引言：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种广泛应用于生物学实验中的化合物。
它具有一种特殊的性质，即可以通过还原型脱氢酶酶促反应，将Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（MTT）还原为可溶性的紫色产物。
这一反应可以用来评估细胞的代谢活性和细胞存活率。
本实验旨在分析MTT实验的原理、操作步骤以及结果解读，并探讨其在生物学研究中的应用。
一、实验原理：MTT实验的原理基于细胞的代谢活性。
MTT溶液在细胞内被还原为可溶性的紫色产物，其浓度与细胞代谢活性成正比。
通过测量产物的吸光度，可以评估细胞的存活率和细胞毒性。
二、实验步骤：1. 细胞预处理：将需要研究的细胞培养在含有适当培养基的培养皿中，并在恒温恒湿的培养箱中孵育至细胞黏附于培养皿底部。
2. 添加MTT溶液：将MTT溶液加入培养皿中，使其与细胞接触。
MTT溶液的浓度和作用时间可以根据实验需要进行调整。
3. 细胞溶解：将MTT溶液去除，加入溶解剂（如DMSO）溶解细胞内的紫色产物。
4. 吸光度测量：将溶解后的细胞溶液转移到96孔板中，使用酶标仪测量吸光度。
吸光度越高，代表细胞的存活率越高。
三、结果解读：MTT实验的结果通常以吸光度值表示。
通过比较实验组与对照组的吸光度值，可以得出以下结论：1. 细胞存活率：实验组与对照组吸光度值的比较可以反映细胞的存活率。
如果实验组的吸光度值较高，说明细胞存活率较高；反之，说明细胞存活率较低。
2. 细胞毒性：若实验组的吸光度值明显低于对照组，说明实验物质对细胞产生了毒性作用。
3. 药物筛选：MTT实验可以用于药物的筛选。
通过比较不同药物处理组的吸光度值，可以评估药物的效果和毒性。
四、MTT实验的应用：1. 细胞增殖和生长研究：MTT实验可以用于评估细胞的增殖和生长情况，对于研究细胞周期和细胞增殖相关的疾病具有重要意义。
MTT法实验方案及结果
Data 10d 7d 14d 21d 28d1020304050NormalOrlistatA 组10μg/g/dB 组20μg/g/dC 组30μg/g/d******天数体重Data 10d7d14d21d28d1020304050Normal OrlistatA 组10μg/g/dB 组20μg/g/dC 组30μg/g/d天数体重MTT 原理、步骤、结果分析方法及注意事项 MTT 原理MTT 全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide ，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT 经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
实验一乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验
引言概述：乳酸菌饮料是一种富含乳酸菌的食品，乳酸菌在食品工业中广泛应用于酸奶、乳饮料等产品中。
本文将详细介绍乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法。
正文内容：一、样品采集和制备1.确定样品采集时机：乳酸菌饮料中的乳酸菌数量会随着储存时间的增加而增加或减少，因此需要在存储时间稳定的情况下进行采集。
2.采集样品方法：使用无菌技术采集样品，避免外部微生物的污染。
3.样品制备：将采集到的样品进行均匀搅拌，以保证样品的均匀性。
二、总菌数检验方法1.琼脂平板法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，在琼脂平板上涂布，经过一定孵育时间后，根据菌落的数量计算总菌数。
2.膜过滤法：将样品通过膜过滤器过滤，将过滤后的膜放置在琼脂平板上孵育，根据菌落的数量计算总菌数。
三、乳酸菌检验方法1.培养基选择：根据乳酸菌的生长特性选择适合的培养基，常见的培养基有MRS培养基、LBS培养基等。
2.乳酸菌的分离：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在选定的培养基上。
经过一定孵育时间后，可以观察到乳酸菌形成的菌落。
3.鉴定乳酸菌：使用形态学观察、生理生化试验和分子生物学方法等进行乳酸菌的鉴定。
四、活菌数检验方法1.孵育培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在含有乳酸菌生长所需营养物质的培养基上。
经过一定孵育时间后，观察活菌的生长情况，计算活菌数。
2.阻碍培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，与含有抑制剂的培养基混合。
通过观察生长情况，计算活菌数。
五、质量指标评价方法1.pH值测定：使用pH计或试纸对乳酸菌饮料中的pH值进行测定，根据标准范围评价产品的质量。
2.乳酸浓度测定：使用乳酸测定仪器或化学试剂对乳酸菌饮料中的乳酸浓度进行测定，根据标准范围评价产品的质量。
3.品尝评价：通过专业的品尝人员进行品尝评价，评估乳酸菌饮料的口感和风味。
总结：乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法包括样品采集和制备、总菌数检验、乳酸菌检验、活菌数检验和质量指标评价方法。
乳酸菌活菌数量检测方法--菌落计数法
乳酸菌活菌数量检测方法--菌落计数法本方法适用于乳酸菌制剂及配合饲料中有效活菌数和杂菌率的测定。
按照国家标准GB/T 14699.1进行抽样，获得样品200g，分装于两个无菌、干燥的玻璃瓶中，贴上标签，注明产品名称、批号、取样日期等信息。
一瓶供检验用，一瓶密封保，以备复查。
一、测定原理：乳酸肠球菌用肠球菌琼脂培养基，杂菌用营养琼脂培养基；培养后利用平板菌落计数法进行计数。
二、培养基与缓冲液配方：（1）营养琼脂培养基，每L蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 18.0g 水稀释至1000ml PH 7.0~7.4（2）肠球菌琼脂培养基，每L蛋白胨 20.0g蔗糖 5.0g 葡萄糖 5.0g 乳糖 5.0g 酵母膏 5.0g氯化钠 4.0g 乙酸钠 1.5gVc 0.5g 琼脂 17.0g 水稀释至1000mlPH 6.5~7.0（3）PH6.8磷酸缓冲液配制方法取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀即得。
三、样品处理：（1）乳酸菌纯品制剂样品测定乳酸菌纯品制剂时，取样量为1g，溶解到100ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为100:1。
（2）配合饲料样品测定饲料样品时，取样量为25g，溶解到225ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为10:1。
四、有效活菌数、杂菌数的测定：（1）本方法采用平板菌落计数法（2）操作方法：1．取磁力搅拌棒装入500ml三角瓶中，再量225ml PH6.8的磷酸缓冲液一并装入三角瓶中灭菌备用。
纯品制剂量取缓冲液100ml。
2．取25g饲料样品放入三角瓶中，在磁力搅拌器中震荡混匀5min后，再放到摇床上37℃，150转/分，充分震荡45min，混匀成1：10稀释液。
纯品制剂样品量为1g，混匀成1：100稀释液。
3．在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释。
用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul缓冲液的离心管内，并在液体中反复吹打5次，在漩涡振荡器上震荡30s混匀（注意每次稀释时更换枪头及充分震荡混匀）。
乳酸菌计算活菌数培养基国标
乳酸菌计算活菌数培养基国标乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，具有很高的益生作用。
在食品工业中，乳酸菌被广泛应用于发酵食品的制作中，如酸奶、乳酸菌饮料等。
为了保证发酵食品的品质和安全性，需要对乳酸菌进行活菌数的检测。
而乳酸菌活菌数的检测方法和标准在我国被统一为《乳酸菌活菌数测定方法》（GB 4789.38-2016）。
乳酸菌活菌数的测定方法主要包括直接计数法和间接计数法两种。
直接计数法是通过显微镜观察乳酸菌在培养基上的菌落数来进行活菌数的估计。
间接计数法则是通过测定乳酸菌产生的酸度或气体量来间接反映活菌数。
在进行乳酸菌活菌数测定之前，首先需要准备好培养基。
培养基的选择对乳酸菌的生长和繁殖起着至关重要的作用。
常用的培养基有MRS培养基、LBS培养基等。
这些培养基能提供乳酸菌所需的营养物质，并且能够抑制其他细菌的生长。
接下来是乳酸菌的接种和培养。
将待测样品接种到培养基上，并且在适宜的温度下进行培养。
乳酸菌的适宜生长温度一般在35℃左右。
在培养的过程中，乳酸菌会利用培养基中的营养物质进行生长和繁殖，最终形成可见的菌落。
乳酸菌活菌数的测定可以通过直接计数法进行。
将培养基上的菌落取出，制备菌悬液后，使用显微镜观察菌落中的乳酸菌数量。
在显微镜下观察时，可以使用乳酸菌特异性染色剂来染色，以便更好地观察和计数。
通过计算所观察到的菌落数和稀释倍数，最终可以得出乳酸菌活菌数的估计值。
除了直接计数法，间接计数法也是一种常用的测定乳酸菌活菌数的方法。
其中，酸度测定法是一种常用的间接计数法。
乳酸菌在发酵过程中会产生乳酸，从而使培养基的酸度增加。
通过测定培养基的酸度变化，可以间接反映出乳酸菌的活菌数。
利用酸度计或pH计进行测定，可以得到乳酸菌活菌数的近似值。
乳酸菌活菌数的测定方法在GB 4789.38-2016中还规定了一些其他的注意事项。
比如，在进行直接计数法时，要求在菌落形成之前进行计数，以避免菌落过大或过小对计数结果的影响。
利用MTT法检测活细胞数量和结果分析
11）计算抑制率，公式[（对照-本底）（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.
MTT法的不足：
原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀 酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内 琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的 晶状甲瓒(Formazan)，将结晶的甲瓒溶解释放， 再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值，OD值的 高低可间接反映活细胞的数量及其活性。它基于 两个假设： 1、只有活细胞能够将MTT还原成为难溶性的蓝紫 色结晶物，而死细胞不能达到； 2、其吸光度与活细胞数量成直线正相关。 但该方法在使用过程中会受到多种因素的干扰。
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞可 使用WST-1，XTT等，培养4 h后可跳过步 骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值） 4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清， 每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速 振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免 疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各 孔的吸光值。 5）对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组 设定3复孔。
五、注意事项与常见问题
1）实验时应设置对照孔，加药孔。对照孔和加药 孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不 同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不 同浓度的药物。 2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整， 并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少 观察不到差异。 3）如果不使用96孔板，培养基超过100 ml，MTT 按照10%的比例加入。 4）MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配 制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融， 最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包 住避光以免分解，配制完后可过滤一下。 5）对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，570nm有 最大吸收值，并且建议以630nm作为参考波长。
MTT法在细菌活性检测及药敏试验中的应用
MTT法在细菌活性检测及药敏试验中的应用作者：来源：《中国医学创新》2011年第05期MTT法在细菌活性检测及药敏试验中的应用蔡燕彭乙华黄义山杨明辉罗书久谢文光基金项目：国家自然科学基金资助（项目批准号：90709010）作者单位：637000 四川川北医学院附属医院通讯作者：谢文光【摘要】目的探讨四甲基偶氮唑盐（MTT）法在细菌活性检测和药敏试验中的应用价值。
方法分别采用MTT法和微量肉汤稀释法检测鲍曼不动杆菌活性以及鲍曼不动杆菌对丁胺卡拉霉素和头孢他啶的敏感性，对两种方法的操作过程和结果进行比较。
用统计软件SPSS 16.0对检测结果进行分析。
结果随着细菌浓度增加，微量肉汤稀释法和MTT法检测的活菌或死菌的吸光度值均增加，但用微量肉汤稀释法检测的同一浓度的活菌和死菌的吸光度值之间差别不大，t检验结果显示差异无统计学意义（P>0.05）；而与用MTT法检测的同一浓度死菌吸光度值相比，MTT法检测的活菌吸光度值明显增加，t检验结果显示差异均有统计学意义（P【关键词】 MTT法；药敏试验；微量肉汤稀释法；鲍曼不动杆菌The application of MTT assay in detecting of bacteria’s activity and susceptibility test CAI Yan，PENG Yi-hua，HUANG Yi-shan，YANG Ming-hui，LUO Shu-jiu，XIE Weng-guang. Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，【Abstract】 Objective To research the applying value of MTT assay （Tetrazolium salt）in detecting the bacteria’s activity and drug sensitivity.Methods Using the MTT assay and broth microdilution methods to detect the Acinetobacter baumanii’s activity and the drug sensitivity of Acinetobacter baumanii to Amikaxinand Ceftazidime.The statistics software spss16.0 was applied to analyze the results.The periods and results of two methods were compared.Results With the concentration of bacteria increasing the optical density of every group detected by the MTT assay or broth microdilution also improved；But there were no difference between the optical density of deadbacteria and living bacteria in the same concentration detected by the broth microdilution method （P>0.05）；When compared with the same concentration of the dead bacteria’s optical density，the optical density of the living bacteria detected by MTT assay increased significantly（P【Key words】 MTT assay； Susceptibility test； Broth microdilution； Acinetobacter baumannii药物敏感试验常用于检测细菌对药物的敏感性，以筛选出有效的抗生素指导临床医生治疗感染性疾病。
食品中酸奶菌活菌数的测定方法研究
食品中酸奶菌活菌数的测定方法研究随着人们对健康和营养的重视，酸奶作为一种富含活菌的乳制品，备受消费者喜爱。
然而，了解食品中酸奶菌活菌数的测定方法对于保证其质量和安全至关重要。
本文将介绍一些常见的测定方法，并探讨其优缺点。
首先，传统的酸奶菌活菌数测定方法是通过使用培养基进行细菌培养，并利用菌落计数法来统计活菌数。
这种方法简单、直接，且被广泛接受和采用。
然而，它存在着一些问题。
首先，这种方法需要一定的培养时间，通常需要24-48小时，因此不能实时监测酸奶中的活菌数。
其次，在菌落计数过程中，存在人为判断的误差，这可能导致结果的不准确性。
另外，部分细菌可能无法在特定的培养基上生长，从而导致漏检。
因此，需要寻找更加快速和准确的测定方法。
近年来，基于分子生物学的酸奶菌活菌数测定方法逐渐受到关注。
其中最常用的是聚合酶链式反应（PCR）和定量聚合酶链式反应（qPCR）。
这些方法通过检测特定基因或DNA序列来确定活菌数。
相较于传统的培养方法，分子生物学方法具有以下优势：快速、高灵敏度、高特异性、无需菌落计数。
特别是qPCR方法，可以在短短几小时内获得结果，且具备较高的准确性和重复性。
然而，这些方法也存在一些限制，如设备的昂贵、技术要求较高以及对样品的前处理步骤，因此在实际应用中仍需谨慎。
此外，近年来光学技术也被用于酸奶菌活菌数的测定。
例如，流式细胞术（FACS）结合活菌染色剂的使用可以快速准确地计数酸奶中的活菌数。
FACS技术通过流式细胞仪对样本中的细胞进行高通量检测，并能同时对多个参数进行测定。
相比传统的培养方法和分子生物学方法，FACS具有更高的精确度和准确性。
然而，这种技术的设备投资和维护成本较高，同时操作也较为复杂。
综上所述，食品中酸奶菌活菌数的测定方法包括传统的培养法、分子生物学方法和光学技术。
每种方法都存在优缺点，需要根据实际需求和实验条件进行选择。
传统的培养法虽然存在一些局限性，但其简单可行性和广泛应用性使其仍然被广泛采用。
MTT法测定瑞士乳杆菌MB 2-1活菌数
MTT法测定瑞士乳杆菌MB 2-1活菌数杨培洁;李腾;陈晓红;李伟;董明盛【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2013(034)020【摘要】以赛里木拉丝酸奶中提取的瑞士乳杆菌MB 2-1(Lactobacillus helveticus MB 2-1)为研究对象,探讨MTT法用于细菌计数的可行性及测量细菌数量的范围,优化MTT法用于瑞士乳杆菌活菌计数的工作波长、MTT和DMSO用量、反应时间.结果表明:在107～109CFU/mL内测出的OD值与细菌浓度呈正向线性关系(R2＞0.99),最佳反应条件为:1.0mL待测菌液与0.2mL MTT溶液在40℃条件下染色反应lh,反应液需要经过12000r/min离心10min,取离心沉淀物溶解于1.0mL二甲基亚砜中,于工作波长510nm处测定此溶液的OD值.MTT比色分析法可用于检测乳酸菌活菌数量.【总页数】4页(P99-102)【作者】杨培洁;李腾;陈晓红;李伟;董明盛【作者单位】南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】TS201.3【相关文献】1.瑞士乳杆菌MB2-1胞外多糖发酵条件优化 [J], 纪鹃;李伟;陈晓红;姜梅;芮昕;董明盛2.源自新疆赛里木酸奶的瑞士乳杆菌MB2-1荚膜多糖提取及其抗氧化活性 [J], 李伟;纪鹃;徐希研;胡波;王凯;徐冬兰;董明盛3.基于高活菌数的瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵工艺优化 [J], 陈庆彩;李敬龙;胡晓珂4.瑞士乳杆菌MB2-1源胞外多糖对10种益生菌生长特性的影响 [J], 黄蓉;李伟;张学亮;韩烁;周子文;莫乔雅;董明盛;芮昕;张秋勤;陈晓红5.MTT-四氯化碳萃取吸光光度法测定活菌数 [J], 任娇蓉;李璐;郜洪文;徐亚同因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乳酸菌活菌数的测定
乳酸菌活菌数的测定1、乳酸菌的定义：一类可发酵糖主要产生大量乳酸菌的细菌的通称。
乳酸菌主要为乳杆菌属，双歧杆菌属和链球菌属。
2、实验用品：恒温培养箱：35℃-37℃冰箱：2℃-5℃均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳鉢天平：感量0.1g无菌试管：18mm×180mm 每人6支，共30支无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）每人7支，共35支无菌锥形瓶：250mL 共5个无菌培养皿：每人7个，共35个（包括空白的5个）涂布棒：共5个MRS琼脂：700mL生理盐水：300mL分装于试管中，每支试管9mL固体样品处理：以无菌操作称取1g样品，置于装有9mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r／min置于9mL-10000r／min均质1min-2min，制成1：10的样品匀液，或置于9mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击均质器拍打1min-2min制成1：10的样品匀液。
3、实验步骤：a.用1mL无菌吸管吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管，制成1：100的样品匀液。
b.另取1mL无菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，直至制成1：1000000的样品匀液。
c.选取1：1000，1：10000，1：100000的样品匀液，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板，使用涂布棒进行表面涂布。
（从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成）d.在35℃-37℃，厌氧培养46h-50h后计数平板上的所有菌落数。
4、工作分配：洗器材全部人包扎吸管，培养皿，试管和锥形瓶：张燕梅张美玲黄雪玲配培养基及分装：杨延静配生理盐水及分装：杨晓玲。
MTT在测定食品中细菌总数的应用研究
22 41803 21959 41 122 47 21 477 21255 21021
23 31799 31322 21 973 48 71 061 61991 61919
24 41752 41341 31 176 49 31 190 21978 21903
25 21130 11903 11 903 50 21 176 21146 21097
211 MTT 营养琼脂、普通 营养琼 脂及 TTC 营 养琼脂 测定食 品细菌总数结果的相关性比较
MTT 法与普通营养 琼脂测 定 50 份 食品 中细 菌总数 结果 表现出很好 的线性 相关关 系, 相关系数 为 r = 01 974。TTC 营 养琼脂与普通营养琼脂相关系数 为 r = 01 930, 说明 MTT 法比
文章编号: 1000- 8020( 2005) 05- 0569- 02
MTT 在测定食品中细菌总数的应用研究
赵贵明 姚文荣 刘沛
中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100025
#实验研究#
食品中细菌总数是反映食品卫生的基本指标, 因此 , 在原 材料、加工、保藏、运输、消费等各个环节进行卫生质量控制时 经常需要检测, 目前除标准检测方法外还有改进的传统 方法, 在营养琼脂中添加 TTC( 氯化三苯四氮唑) 就是应用 最广泛的 一种, 尽管 已证 明 该方 法 与 标准 方 法检 测 结果 存 在 一定 差 异[1] , 但细菌在该培养基上 可生长 成红色 菌落, 易于 识别, 许 多实验室一直在使用。作者通过实 验, 以 3- ( 4, 5- 二甲 基噻唑 -2)- 2, 5- 二苯基四氮唑盐( 简称 MTT ) 替代 TTC 检测了 50 份各 类食品, 与 标准 方 法进 行 了 对比, 分析 了 存 在 差异 的 原 因, MTT 完全可以用于食 品中细菌计数, 现报告如脂和 MTT 营养琼 脂三种 培养基 测
MTT法检测细菌细胞数的主要影响因素分析_吴窈画
标准菌株 E． coli ATCC 25922 P． aeruginosa ATCC BAA427 S． pneumoniae ATCC 6305 B． fragilis ATCC 25285
1． 1． 1
菌株 由 ATCC 引进的实验菌株包括大 肠埃希菌（ Escherichia coli，ATCC 25922 ） 、 铜绿假
1． 2． 3
脂（ TSA， 含或不含 5% 羊血 ） 、 脑心浸液液体培养 （ BHI ） （ BHIA ， 基 和脑心浸液琼脂 含 5% 羊血） 。 1． 1． 3 主要试剂 5 mg / mL MTT 溶液［6］（ 取 100 mg MTT 溶于 20 mL pH 7． 4 的 0． 01 mol / L PBS 缓 4 ℃ 避光保存 ） 、 冲液中， 充分溶解后过滤除菌， 三
［25 ］ ， 性试验、 肿瘤放射敏感性测定 以及微生物活 ［67 ］ 。 菌 计数 微生物学用于细菌计数的常规方法
基金项目： 国家科技型中小企业技术创新基金 （ 08C26213200567 ） 作者简介： 吴窈画 女， 硕士， 工程师。研究方向为微生物样本采集和传递技术。 Tel： 02586200378 ， Email： wuyh@ citotest． com． cn 0425 ； 修回日期： 20110522 收稿日期： 2011-
同时进行平板菌落计数法测定 ： 对测试样品进 行 10 倍梯度稀释， 取各梯度菌液分别做活菌平板 培养计数。 1． 2． 2 还原反应时间和 MTT 剂量分析 取 4 种 病原菌对数生长期的纯培养物 （ 各菌株所用培养
［10 ］ 基及培养条件 如表 1 ） ， 于适量 0． 90% NaCl 中 9 分别制成约 3． 0 × 10 cfu / mL 细菌悬液， 连续 3 倍
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62MTT法测定乳酸菌活菌数的研究黄立坤，杜鹏2，霍贵成*乳品科学教育部重点实验室（东北农业大学） (哈尔滨 150030)摘要建立一种快速、稳定、灵敏并可反映细菌活性的细菌计数方法。
以乳酸菌中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为研究对象，探讨MTT法用于细菌计数的可行性及测量细菌数量的范围、反应时间、MTT 的用量、是否加入溶解剂等实验条件。
结果：保加利亚乳杆菌在(1.0×105～2.18×107) cfu/mL内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间1.5 h，MTT添加量20 μL，测量前用DMSO溶解；嗜热链球菌在(2.0×105～5.12×107) cfu/mL范围内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间2.0 h，MTT添加量20 μL，可不添加溶解剂直接测量。
MTT比色分析法可用于检测乳酸菌活菌数量。
关键词MTT；保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；活菌计数Inquiring into the Method of Counting Live Germ with MTTAbstract To establish a rapid, steady and sensitive bacteria-counting method that could reflect the bacteria’s activity. Lactabacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and St reptococcus thermophilus were employed to discuss the feasibility of application of MTT method to bacteria-counting and determine the conditions of the assay, including linear range, reaction time, MTT dosage and whether solvent is added etc.. Results: The optical density at 570 nm is positively related to the concentration of L.delbrueckii ssp. bulgaricus when the number of the bacteria is in the range of (1.0×105~2.18×107) cfu/mL, and reacting time is 1.5 h, MTT dosage is 20 μL, and DMSO is used as solvent before assay; For St.thermophilus , the optical density at 570 nm is positively related to the concentration of the bacteria when the number of the bacteria is in the range of (2.0×105~5.12×107) cfu/mL, and reacting time is 2.0 h, MTT dosage is 20 μL and solvent is not added.. Conclusion: MTT colorimetry could be used to measure the viability of lactic acid bacteria.Keywords MTT colorimetry ；lactobacillus bulgaricus ；Streptococcus thermophilus ；live germ counting 基金项目：国家科技基础条件平台项目（2005DKA21204-08）资助。
* 通讯作者活菌计数在科研生产中有着广泛的应用，用于细菌计数的常规方法有平板稀释计数法(SPC)，自动菌数测定仪法，浊度法，菌体干重法等。
SPC法为经典方法，但方法繁琐，耗时长，不能及时反映菌体生长情况，不适合于做大批量的实验；后几种方法不能区分细胞的死活，且测定结果受培养基、代谢产物的影响较大[1]。
试验用MTT快速活菌计数法，以克服上述缺点，且工作量小，操作简单，快速，重复性好，能区分死活菌等。
MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑，结构式如图1。
MTT法基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT的四唑环还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜（Fonmazan），而死细胞无此作用[2]。
形成的甲臜颗粒沉积于细胞内或细胞周围，在一定细胞浓度范围内，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜，通过检测光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性[3]。
1 材料与方法1.1 材料图1 MTT的分子结构式1.1.1 菌种保加利亚乳杆菌（L . delbrukki subsp. bulgaricus ，L.b ）1.8501菌株和嗜热链球菌（S .thermophilus ，S.t ）3.8501菌株，均为乳品科学教育部重点实验室（KLDS ）提供。
1.1.2 试剂及溶液（1）试剂：MTT，二甲亚砜(DMSO)。
（2）MTT溶液配制：称取100 mg MTT (Amresco 分装)于小烧杯中。
加20 m L P B S (0.0l m o l /L ，pH=7.2)，使其充分溶解，用0.22 μm微孔过滤器除菌，分装于1.5 mL的EP管中，4℃避光保存。
两周内使用，时间过长，溶液中易进微生物起反应，改变MTT溶液的浓度。
63（3）PBS溶液配制（用于溶解MTT）：8 g氯化钠，1.15 g磷酸氢二钾，0.2 g磷酸二氢钾去离子水定容至1 000 mL，用精密pH计调节pH=7.2，溶液浓度为0.01 mol/L。
121℃灭菌15 min，室温保存。
（4）PBS溶液配制（用于稀释菌液）：8.5 g氯化钠，0.2 g氯化钾，2.85 g磷酸氢二钠，0.27 g磷酸二氢钾，去离子水定容至1 000 mL，pH值调至7.0，121℃灭菌15 min，室温保存。
（5）培养液的配制：保加利亚乳杆菌用液体MRS培养，嗜热链球菌用M17+1.5%乳糖培养。
1.1.3 设备BID-RAD 680全自动酶标仪：日本；HVE-50高温高压灭菌锅：HIRAYAMA，日本；DHP-9272电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；VD-1320洁净工作台：北京东联哈尔滨仪器制造有限公司；METTLER-TOLEDO320pH计：瑞士；GL-21冷冻离心机：上海市离心机械研究所；芬兰可调式移液器：热电上海仪器有限公司。
1.2 方法1.2.1 乳酸菌的培养方法将500 mL的液体培养基装入三角瓶中，121℃灭菌15 min后，接入3％的种子培养液，1.8501菌株于37℃培养12 h~15 h，3.8501菌株于42℃培养14 h～16 h，然后收获菌体。
1.2.2 平板菌落计数法将不同稀释度的菌液0.1 mL加入到预先准备好的固体平皿培养基中，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20 min～30 min，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温箱中培养，48 h后计数。
1.2.3 MTT比色实验（1）取发酵好的菌液，用灭好菌的PBS稀释液倍比稀释成10个浓度，分别对不同浓度的菌液做MTT比色实验，同时选择合适的稀释度，做平板菌落计数。
（2）用微量吸液器吸取不同浓度的发酵液100 μL，分别加入96孔酶标板中，每个样液做5个复孔，同时设阴性对照。
（3）用微量吸样器在96孔酶标板中含有样品的各孔分别加入10 μL或20 μL的MTT应用液，1.8501菌株于37℃、3.8501菌株于42℃恒温培养箱放置数小时后取出，向各孔分别加入100 μL的DMSO，用全自动酶标仪于570 nm处测定OD 570值，测量前振动60 s。
2 结果与讨论2.1 甲臜在DMSO溶剂中的光吸收值甲臜的DMSO溶液呈蓝紫色，不同的文献报道其吸收峰值有所差异，分别有在525 nm [3] ，550 nm [4]，570 nm [5]处的。
考虑到实验的具体影响因素不同，需具体测定实验中甲臜溶液的吸收光谱。
扫描范围为450 nm~650 nm，测量结果如图2所示，由图可知，甲臜的最大吸收峰在570 nm处。
⊶䭓 QP2'ؐ图2 甲臜最大吸收峰的确定2.2 最佳反应条件的确定不同菌种因活性不同其反应时间也不一样。
通过观察菌液颜色变化，分别设定三个反应时间：1.8501菌株为0.5 h，1.0 h，1.5 h；3.8501菌株为2.0 h，3.0 h，4.0 h。
加入MTT的量设为10 μL或20 μL两个梯度，反应结束后立即测定OD 570值，每孔加入100 μL 的DMSO后再测一次。
由测量结果可知，各孔OD 570值随反应时间的延长、MTT的量增加而有所增加，在测量范围内，细菌数与OD 570值均呈正相关。
但1.8501菌株在反应1.5 h，加入20 μL MTT，并且添加DMSO溶剂时，相关性最好，相关系数r＝0.997，P<0.01，差异极显著；3.8501菌株在反应2.0 h，加入20 μL MTT，不添加DMSO溶剂时，相关性最好，相关系数r＝0.987，P<0.01，也具有极显著的相关性。
不同条件下的线性相关分析如表1、表2所示。
表1 1.8501菌株活菌数与OD 570值线性相关结果反应时间 /h MTT添加量 /μL R 2（反应后直接测OD 570值）R 2（添加DMSO 后再测OD 570值）0.5100.9580.9681.0100.9430.8681.5100.9370.9270.5200.9610.9921.0200.9500.9131.5200.9570.997表2 3.8501菌株活菌数与OD 570值线性相关结果反应时间 /h MTT添加量 /μLR 2（反应后直接测OD 570值）R 2（添加DMSO后再测OD 570值）2.03.04.02.03.04.01010102020200.9620.9340.9540.9870.9780.9620.9590.9550.9170.9520.9730.9702.3 干扰物对测定结果的影响对实验过程所要接触到的介质作干扰实验，在这里以DMSO为参比，MTT溶液、PBS溶液、空白培养基，死菌体(将活菌液在100℃沸水浴煮30 min)作为干扰物，用上述的MTT测定方法分别测定吸光值，结果如表3所示。