MTT法测定乳酸菌活菌数的研究

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MTT法测定乳酸菌活菌数的研究

黄立坤，杜鹏2，霍贵成*

乳品科学教育部重点实验室（东北农业大学） (哈尔滨 150030)

摘要建立一种快速、稳定、灵敏并可反映细菌活性的细菌计数方法。以乳酸菌中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为研究对象，探讨MTT法用于细菌计数的可行性及测量细菌数量的范围、反应时间、MTT 的用量、是否加入溶解剂等实验条件。结果：保加利亚乳杆菌在(1.0×105～2.18×107) cfu/mL内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间1.5 h，MTT添加量20 μL，测量前用DMSO溶解；嗜热链球菌在(2.0×105～5.12×107) cfu/mL范围内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间2.0 h，MTT添加量20 μL，可不添加溶解剂直接测量。MTT比色分析法可用于检测乳酸菌活菌数量。关键词MTT；保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；活菌计数

Inquiring into the Method of Counting Live Germ with MTT

Abstract To establish a rapid, steady and sensitive bacteria-counting method that could reflect the bacteria’s activity. Lactabacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and St reptococcus thermophilus were employed to discuss the feasibility of application of MTT method to bacteria-counting and determine the conditions of the assay, including linear range, reaction time, MTT dosage and whether solvent is added etc.. Results: The optical density at 570 nm is positively related to the concentration of L.delbrueckii ssp. bulgaricus when the number of the bacteria is in the range of (1.0×105~2.18×107) cfu/mL, and reacting time is 1.5 h, MTT dosage is 20 μL, and DMSO is used as solvent before assay; For St.thermophilus , the optical density at 570 nm is positively related to the concentration of the bacteria when the number of the bacteria is in the range of (2.0×105~5.12×107) cfu/mL, and reacting time is 2.0 h, MTT dosage is 20 μL and solvent is not added.. Conclusion: MTT colorimetry could be used to measure the viability of lactic acid bacteria.

Keywords MTT colorimetry ；lactobacillus bulgaricus ；Streptococcus thermophilus ；live germ counting 基金项目：国家科技基础条件平台项目（2005DKA21204-08）资助。* 通讯作者

活菌计数在科研生产中有着广泛的应用，用于细菌计数的常规方法有平板稀释计数法(SPC)，自动菌数测定仪法，浊度法，菌体干重法等。SPC法为经典方法，但方法繁琐，耗时长，不能及时反映菌体生长情况，不适合于做大批量的实验；后几种方法不能区分细胞的死活，且测定结果受培养基、代谢产物的影响较大[1]。试验用MTT快速活菌计数法，以克服上述缺点，且工作量小，操作简单，快速，重复性好，能区分死活菌等。

MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑，结构式如图1。MTT法基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT的四唑环还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜（Fonmazan），而死细胞无此作用[2]。形成的甲臜颗粒沉积于细胞内或细胞周围，在一定细胞浓度范围内，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜，通过检测光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性[3]。1 材料与方法

1.1 材料

图1 MTT的分子结构式

1.1.1 菌种

保加利亚乳杆菌（L . delbrukki subsp. bulgaricus ，L.b ）1.8501菌株和嗜热链球菌（S .thermophilus ，S.t ）3.8501菌株，均为乳品科学教育部重点实验室（KLDS ）提供。1.1.2 试剂及溶液

（1）试剂：MTT，二甲亚砜(DMSO)。

（2）MTT溶液配制：称取100 mg MTT (Amresco 分装)于小烧杯中。加20 m L P B S (0.0l m o l /L ，pH=7.2)，使其充分溶解，用0.22 μm微孔过滤器除菌，分装于1.5 mL的EP管中，4℃避光保存。两周内使用，时间过长，溶液中易进微生物起反应，改变MTT溶液的浓度。

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（3）PBS溶液配制（用于溶解MTT）：8 g氯化钠，1.15 g磷酸氢二钾，0.2 g磷酸二氢钾去离子水定容至1 000 mL，用精密pH计调节pH=7.2，溶液浓度为0.01 mol/L。121℃灭菌15 min，室温保存。

（4）PBS溶液配制（用于稀释菌液）：8.5 g氯化钠，0.2 g氯化钾，2.85 g磷酸氢二钠，0.27 g磷酸二氢钾，去离子水定容至1 000 mL，pH值调至7.0，121℃灭菌15 min，室温保存。

（5）培养液的配制：保加利亚乳杆菌用液体MRS培养，嗜热链球菌用M17+1.5%乳糖培养。1.1.3 设备

BID-RAD 680全自动酶标仪：日本；HVE-50高温高压灭菌锅：HIRAYAMA，日本；DHP-9272电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；VD-1320洁净工作台：北京东联哈尔滨仪器制造有限公司；METTLER-TOLEDO320pH计：瑞士；GL-21冷冻离心机：上海市离心机械研究所；芬兰可调式移液器：热电上海仪器有限公司。1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培养方法

将500 mL的液体培养基装入三角瓶中，121℃灭菌15 min后，接入3％的种子培养液，1.8501菌株于37℃培养12 h~15 h，3.8501菌株于42℃培养14 h～16 h，然后收获菌体。1.2.2 平板菌落计数法

将不同稀释度的菌液0.1 mL加入到预先准备好的固体平皿培养基中，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20 min～30 min，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温箱中培养，48 h后计数。1.2.3 MTT比色实验

（1）取发酵好的菌液，用灭好菌的PBS稀释液倍比稀释成10个浓度，分别对不同浓度的菌液做MTT比色实验，同时选择合适的稀释度，做平板菌落计数。

（2）用微量吸液器吸取不同浓度的发酵液100 μL，分别加入96孔酶标板中，每个样液做5个复孔，同时设阴性对照。

（3）用微量吸样器在96孔酶标板中含有样品的各孔分别加入10 μL或20 μL的MTT应用液，1.8501菌株于37℃、3.8501菌株于42℃恒温培养箱放置数小时后取出，向各孔分别加入100 μL的DMSO，用全自动酶标仪于570 nm处测定OD 570值，测量前振动60 s。2 结果与讨论

2.1 甲臜在DMSO溶剂中的光吸收值

甲臜的DMSO溶液呈蓝紫色，不同的文献报道其吸收峰值有所差异，分别有在525 nm [3] ，550 nm [4]，570 nm [5]处的。考虑到实验的具体影响因素不同，需

具体测定实验中甲臜溶液的吸收光谱。扫描范围为450 nm~650 nm，测量结果如图2所示，由图可知，甲臜

的最大吸收峰在570 nm处。

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图2 甲臜最大吸收峰的确定

2.2 最佳反应条件的确定

不同菌种因活性不同其反应时间也不一样。通过观察菌液颜色变化，分别设定三个反应时间：1.8501菌株为0.5 h，1.0 h，1.5 h；3.8501菌株为2.0 h，3.0 h，4.0 h。加入MTT的量设为10 μL或20 μL两个梯度，反应结束后立即测定OD 570值，每孔加入100 μL 的DMSO后再测一次。

由测量结果可知，各孔OD 570值随反应时间的延长、MTT的量增加而有所增加，在测量范围内，细菌数与OD 570值均呈正相关。但1.8501菌株在反应1.5 h，加入20 μL MTT，并且添加DMSO溶剂时，相关性最好，相关系数r＝0.997，P<0.01，差异极显著；3.8501菌株在反应2.0 h，加入20 μL MTT，不添加DMSO溶剂时，相关性最好，相关系数r＝0.987，P<0.01，也具有极显著的相关性。不同条件下的线性相关分析如表1、表2所示。

表1 1.8501菌株活菌数与OD 570值线性相关结果

反应时间 /h MTT添加量 /μL R 2（反应后直接测OD 570值）

R 2（添加DMSO 后再测OD 570值）

0.5100.9580.9681.010

0.943

0.868

1.5100.9370.9270.5200.9610.9921.0200.9500.9131.5

20

0.957

0.997

表2 3.8501菌株活菌数与OD 570值线性相关结果

反应时间 /h MTT添加量 /μL

R 2（反应后直接测OD 570值）

R 2（添加DMSO后再测OD 570值）

2.03.04.02.03.04.0

101010202020

0.9620.9340.9540.9870.9780.962

0.9590.9550.9170.9520.9730.970

2.3 干扰物对测定结果的影响

对实验过程所要接触到的介质作干扰实验，在这里以DMSO为参比，MTT溶液、PBS溶液、空白培养基，死菌体(将活菌液在100℃沸水浴煮30 min)作为干扰物，用上述的MTT测定方法分别测定吸光值，结果如表3所示。