乳腺癌内TNFR1的表达及与临床病理因素的相关性

乳腺癌内TNFR1的表达及与临床病理因素的相关性目的：检测乳腺癌组织内TNFR1的表达，并分析与临床病理因素的相关性。

方法：选取2015年9月-2016年1月牡丹江肿瘤医院乳腺外科手术切除的30例乳腺癌标本为试验组，距离肿瘤边缘1 cm处的癌旁组织为对照组。

应用Real-time PCR和免疫组织化学技术分别检测TNFR1 mRNA和蛋白的表达。

结果：Real-time PCR检测显示，试验组TNFR1 mRNA的表达量为（0.07±0.03），高于对照组的（0.03±0.01），比较差异有统计学意义（P＜0.05）；免疫组织化学染色显示，试验组TNFR1蛋白呈棕黄色，主要分布于细胞质内，呈弥漫性或局灶性分布，对照组TNFR1蛋白表达不明显；试验组TNFR1蛋白表达为（145.36±3.46），明显高于对照组的（119.69±14.28），比较差异有统计学意义（P＜0.05）；乳腺癌内TNFR1蛋白的表达与患者年龄、肿瘤大小均无关（P>0.05），而与淋巴结转移及临床分期均密切相关（P＜0.05）。

结论：乳腺癌内TNFR1的表达可作为判断乳腺癌复发转移的重要标记物。

腫瘤坏死因子受体1（Tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）是分子量为55 kD的Ⅰ型跨膜受体，与肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）结合后可介导炎症、细胞增殖、凋亡等多种生物学效应[1-3]。

TNFR1不仅存在于巨噬细胞、单核细胞等正常细胞表面，也存在于血液系统、消化系统等多种肿瘤细胞表面[4-6]，但乳腺癌内TNFR1的表达及临床意义尚不明确。

本研究将采用Real-time PCR和免疫组织化学技术检测乳腺癌和癌旁组织内TNFR1 mRNA和蛋白质的表达，并从蛋白水平探讨TNFR1的表达与乳腺癌临床病理因素的相关性，为进一步明确乳腺癌的发生、发展机制提供依据。

现报道如下。

1 资料与方法
1.1 一般资料选取2015年9月-2016年1月牡丹江肿瘤医院（笔者在该医院实习）乳腺外科手术切除的30例乳腺癌标本为试验组，另取距离肿瘤边缘1 cm 处的癌旁组织为对照组。

两组中每例标本各取两处分别放入液氮罐内冷冻用于Real-time PCR技术检测以及放入10%的福尔马林溶液内固定用于免疫组织化学染色。

纳入标准：经临床病理诊断明确癌组织和癌旁组织成分。

排除标准：显微镜下排除坏死组织。

患者均为女性，平均年龄（55.00±10.34）岁；淋巴结转移18例，无淋巴结转移12例；根据WHO TNM分期标准，确定乳腺癌患者的临床分期；患者术前均未接受任何放、化疗治疗，术后病理证实均为乳腺癌；患者均对本研究知情同意，且本研究已经院伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂鼠抗人TNFR1抗体购自美国Santa Cruz公司；Trizol试剂、RT-PCR试剂盒、2×SYBR Premix Ex Taq均购自美国Invitrogen公司；SABC免疫组化染色试剂盒、DAB均购自武汉博士德生物工程有限公司。

PCR引物由上海博亚生物工程公司合成。

1.3 方法
1.3.1 免疫组化SABC法一抗TNFR1工作浓度（1︰800），DAB显色，染
色步骤按试剂盒说明书进行。

细胞膜或细胞质呈棕黄色染色为阳性。

应用彩色病理图像分析系统测定随机选取的5个高倍视野内TNFR1蛋白的相对表达量，取平均值灰度值（Mean gray value，MGV）作为代表值。

1.3.2 Real-time PCR检测按照试剂盒说明书操作，Trizol法分别提取乳腺癌组织和癌旁组织总RNA，RT-PCR逆转录cDNA，SYBR Premix Ex Taq试剂盒用于Real-time PCR定量检测。

引物序列如下，TNFR1：5’-GCCAGGAGAAACAGAACAC-3，（forward），5’-CCGTTGGTAGCGATACATTA-3，（reverse）；U6作为内参序列为：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3，（forward）and 5’-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3，（reverse）。

每个样品重复三次，采用2-ΔΔCT 法对TNFR1 mRNA表达进行统计学分析。

1.4 统计学处理使用SPSS 15.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 乳腺癌组织内TNFR1 mRNA的表达以GAPDH为内参，通过Real-time PCR检测30例乳腺癌组织和癌旁组织内TNFR1 mRNA的表达差异，按2-ΔΔCT 量化分析试验组TNFR1 mRNA的表达量为（0.07±0.03），是对照组表达量（0.03±0.01）的2.34倍，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 乳腺癌组织内TNFR1蛋白的表达光镜下观察乳腺癌内TNFR1蛋白免疫组化SABC染色呈棕黄色，主要分布于细胞质内，呈弥漫性或局灶性分布；癌旁组织TNFR1蛋白表达不明显（图1）；试验组TNFR1蛋白表达为（145.36±
3.46），呈高表达，明显高于对照组的（119.69±1
4.28），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 乳腺癌组织内TNFR1蛋白的表达与临床病理因素的关系乳腺癌内TNFR1蛋白的表达与患者年龄、肿瘤大小均无关（P>0.05），而与淋巴结转移及临床分期密切均相关（P＜0.05）。

见表3。

3 讨论
乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一，淋巴结转移是多数患者死亡的主要原因，因此有效控制淋巴結转移对改善乳腺癌患者预后尤为重要[7-10]。

TNF-α最主要的生物学活性就是通过与TNFR1受体结合发挥抗肿瘤效应。

大量研究证实肿瘤组织内TNFR1的表达与肿瘤进展、分化、转移等临床病理因素密切相关，可作为推断肿瘤预后的独立因素[11-15]。

文献[16]采用免疫组化法检测胃癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜内TNFR1的表达，结果证实胃癌组织内TNFR1的表达均比癌旁组织及正常黏膜显著增高，并且胃癌组织内TNFR1的表达与肿瘤分化程度有关。

同样，Hosono等[17]、Takahashi等[18]对大肠癌的研究
也显示TNFR1的表达与肿瘤的分化程度及分期有关，而与其他临床病理因素无关。

而且研究发现，TNFR1表达与慢性髓性白血病的恶性程度也存在一定内在联系[19-20]。

但关于乳腺癌内TNFR1的表达及临床意义的研究目前还未见详尽报道，因此检测乳腺癌组织内TNFR1的表达并分析与临床病理因素的相关性具有十分重要的意义。

本研究首先采用Real-time PCR和免疫组化技术分别从基因和蛋白水平检测了乳腺癌和癌旁组织内TNFR1的表达，结果发现乳腺癌内
TNFR1 mRNA和蛋白质的表达水平均明显高于癌旁组织（P＜0.05），这意味着TNFR1在乳腺癌的发生和发展过程中发挥重要作用，高表达的TNFR1可能介导了TNF-α对肿瘤细胞的杀伤作用。

接下来本研究进一步分析了乳腺癌内TNFR1蛋白表达水平与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期等病理因素的相关性，结果显示，乳腺癌内TNFR1的表达与患者年龄、肿瘤大小等因素均无关（P>0.05），而与淋巴结转移、临床分期密切均相关（P＜0.05）。

淋巴结未转移者TNFR1蛋白表达水平明显高于淋巴结转移者，表明TNFR1的表达高低可能与乳腺癌的恶性程度相关。

肿瘤恶性程度越高，TNFR1表达水平越低，意味着肿瘤细胞越容易逃避TNF-α的毒性作用。

同样，Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者TNFR1的表达水平明显高于Ⅲ、Ⅳ期，这进一步证明肿瘤形成初期机体就刺激肿瘤细胞表面表达更多的TNFR1，以抑制肿瘤的进展和转移。

由此可见，检测TNFR1可作为预测乳腺癌淋巴结转移趋势的重要标记物。

綜上所述，TNFR1在乳腺癌内呈高表达，并可能在乳腺癌的发生及发展进程中发挥重要作用，可作为判断乳腺癌复发转移的重要标记物，但有关乳腺癌内TNFR1如何发挥作用的相关机制还有待进一步研究。

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