基于正交设计和指纹图谱法的白诃颗粒水提工艺研究_张丽飞
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Traditional Materia Medica, Chongqing 400065, China) Abstract: Objective To provide reference for the industrial production of Baihe Granules by optimization of water extraction process parameters. Methods With extraction amount of anemoside B4 and yield of extract as comprehensive evaluation indices, orthogonal test was adopted to optimize water extraction technology and to establish the fingerprint of Baihe Granules to confirm the rationality of the optimum extraction process. Results The descending order of the effect of influencing factors on water extraction was as follows: decoction times＞water amount＞decoction time. The optimal process parameters were as follows: decocting by eight volumes of water for three times, one hour for each time. Conclusion These optimized technologies are stable, feasible and suitable for the standardized production of Baihe Granules. Key Words: Baihe Granules; extraction technology; orthogonal test; fingerprint; anemoside B4; yield of extract
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食品与药品 Food and Drug 2016年第 18卷第1期
2.1.6 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品
溶液各10 μL 注入液相色谱仪，依法测定，外标
法计算含量，即得。
2.2 出膏率的测定
精密量取已定容至2000 mL提取液20.0 mL，
置入已干燥至恒重的蒸发皿，水浴蒸干后于105
中图分类号： R284.2
文献标识码：A
文章编号：1672-979X（2016）01-0016-04
Study on Water Extraction Process of Baihe Granules Based on Orthogonal Design and Fingerprint
ZHANG Li-fei1, JIA Cheng-you1,2, LUO Xiang1, GAO Zi-ping1 (1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China; 2. Chongqing Academy of Chinese
鉴于传统汤剂煎煮、携带、服用不便，本 研究欲将汤剂研制成颗粒剂，在保持其综合疗效 的前提下，克服汤剂的不足[3]。研究以出膏率和 君药指标性成分白头翁皂苷B4综合评分为评价 指标，采用正交试验结合指纹图谱法优选白诃颗 粒的最佳水提工艺[4~6]，以期为白诃颗粒的工业 化制备奠定基础。 1 仪器与材料
白头翁汤出自汉代张仲景《伤寒论》，由 白头翁、黄连、黄柏、秦皮四味药物组成，具有 清热解毒，凉血止痢之功效，主治热痢下重，腹
痛里急，脓血杂下，肛门灼热，苔黄，脉弦数者 [1]。研究证实，白头翁汤对细菌性痢热痢、阿米 巴痢疾，慢性溃疡性结肠炎、结肠炎等疾病疗效
收稿日期：2015-08-06 作者简介: 张丽飞（1990-），女，河南驻马店人，硕士研究生，研究方向：中西医结合治疗皮肤病研究
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食品与药品 Food and Drug 2016年第 18卷第1期
基于正交设计和指纹图谱法的白诃颗粒水提工艺研究
张丽飞1，贾成友1,2，罗祥1，高子平1*
（1. 成都中医药大学，四川 成都 611137；2. 重庆市中药研究院，重庆 400065）
摘 要：目的 优选白诃颗粒水提工艺，为该制剂的工业化生产提供参考。方法 以白头翁皂苷B4提取量和干膏
21
2
2
2 23.88 0.7249 77.85
31
3
3
3 28.10 0.8871 93.79
42
1
2
3 29.12 0.8230 91.04
52
2
3
1 29.92 0.9281 98.81
62
3
1
2 19.27 0.5484 60.49
73
1
3
2 28.74 0.9171 96.56
83
2
1
3 21.57 0.6510 70.08
93
3
2
1 29.69 0.9392 99.22
K1 71.143 76.463 57.453 78.940
K2 83.447 82.247 89.370 78.300
K3 88.620 85.500 96.387 84.970
R 17.477 8.037 38.934 6.670
表3 水提工艺方差分析
利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系 统》（2004A 版）软件，对不同提取工艺样品 HPLC色谱图进行叠加比较[7]，结果见图2。
S1～S9-不同提取工艺供试品 9-白头翁皂苷B4
图2 供试品HPLC指纹谱图 由图2可见，不同提取工艺样品共标定了10 个共有峰，各共有峰除峰面积大小有别外，出峰 时间无差异，说明该研究不同提取工艺对处方 中成分的提取无质的改变，仅量的差异改变。直 观分析可知，S9样品9号峰最大，S1样品9号峰 最小，说明S9样品中白头翁皂苷B4提取量值最 大，S1最小。其余样品9号峰分布二者中间，提 示不同提取工艺对白头翁皂苷B4提取量大小有 显著影响。S1，S4，S6，S9供试品提取工艺见 表4，具体分析将在讨论部分阐述。
℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，精
密称定重量，计算出膏率，出膏率=［浸膏重量
×100/药材重量］×100 %。
2.3 水提工艺优选
选择加水量（A）、煎煮时间（B）和煎
煮次数（C）为考察因素，每个因素设定3个水
平，以出膏率和白头翁皂苷B4提取量的综合评
分[OD=0.4W1/Wmax1+0.6W2/Wmax2]为评价指标优 化水提工艺[6]，因素水平见表1，正交试验安排
Waters-e 2695-2998高效液相色谱仪（美 国Waters公司）；CPA 225D型电子天平（十万 分之一，北京赛多利斯）；AW220型电子天平 （万分之一，日本岛津）；Millipore Synergy UV 型超纯水机（美国Millipore）.
药材饮片（白头翁系四川博仁药业有限责 任公司提供，其余药味系重庆慧远药业有限公司 提供）经鉴定为正品，符合中国药典2010年版 一部标准要求；白头翁皂苷B4对照品（批号： 111766-200601，中国食品药品检定研究院）； 乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；水为自制超 纯水；其余试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 白头翁皂苷B4的含量测定 2.1.1 色谱条件 色谱柱为Sapphire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） ；洗脱剂为乙腈-0.1 %磷 酸溶液（25∶75）；体积流量1.2 mL/min；柱温 30 ℃；检测波长为201 nm，进样量为10 μL，采 集时间为60 min。 2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取白头翁皂苷 B4对照品11.80 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇适 量使溶解，再加至刻度，摇匀，得贮备液。精 密量取贮备液4.0 mL置入10 mL量瓶，加甲醇至 刻度，摇匀，即得每1 mL含白头翁皂苷B4 0.472
及结果见表2，方差分析见表3。
表1 L9(34)正交试验设计因素水平表
水平
A /倍
因素 B /h
C /次
1
6
0.5
1
2
8
1.0
2
3
10
1.5
3
表2 L9(34) 正交试验安排及结果
试验 号A
因素 BC
D
评价指标 干膏收 白头翁皂 率/% 苷B4/g
综合 评分
11
1
1
1 15.71 0.3293 41.79
方差来源 离差平方和 自由度 F值
P
A
483.569
B
103.112
C
2583.712
注: F0. 05( 2, 2) = 19. 0
2
6.672 >0.05
2
1.423 >0.05
2
35.648 *<0.05
以综合评分为考察指标，根据表2中极差R 值大小，各因素对水工艺作用主次为C＞A＞B ＞D，以极值最小的因素D为误差项进行方差分 析，结果表明，因素C有显著性影响。结合生产 实际，确定最佳提取工艺为A2B2C3，即加8倍量 水回流提取3次，每次1.0 h。 2.4 验证试验
得率为综合评价指标，采用正交试验设计优化水提工艺参数，并建立指纹图谱印证白诃颗粒最佳水提工艺的
合理性。结果 水提制备工艺影响因素大小依次是：煎煮次数>加水量> 煎煮时间，最佳制备工艺条件为处方
药材加8倍量水，提取3次，每次1 h。结论 优选得到的工艺稳定可行，重复性好，可用于工业化生产。
关键词: 白诃颗粒；提取工艺；正交试验；指纹图谱；白头翁皂苷B4；出膏率
mg的对照品溶液。 2.1.3 供试品溶液的制备 按处方1的量称取87 g 药材，加水煎煮，滤过，合并滤液，定容至2000 mL。取供试液适量，12 000 r/min离心5 min，取 上清液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。 2.1.4 专属性检验 分别精密吸取供试品溶液、对 照品溶液与空白甲醇溶液各10 μL，注入液相相 色谱仪，记录色谱图，见图1。结果表明，阴性 对照溶液色谱图中与供试品在对照品峰相应保留 时间处未出色谱峰。
E-mail: 917123825@ *通讯作者: 高子平（1966-），女，教授，硕士研究生导师。研究方向：中西医结合治疗皮肤病研究
E-mail：gaoziping@
食品与药品 Food and Drug 2016年第 18卷第1期
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确切[2]。白诃汤是在白头翁汤和诃子散的基础上 加减马齿苋等药味组成，该方不仅保存了白头翁 汤清热解毒，凉血止痢之效，而且融合了诃子散 补敛肺气，止泻收脱之功，有效预防了滑泄不 禁，气虚欲脱现象的出现，临床止痢效果显著。
食品与药品 Food and Drug 2016年第 18卷第1期
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供试品 S1 S4 S6 S9
3 讨论
表4 不同供试品提取工艺
溶媒用量/倍 提取时间/min 提取次数/次
6
30
1
8
30
2
8
90
1
10
90
2
提取工艺是制剂制备过程中很要的一个
环节，大量研究表明，提取工艺对制剂疗效影响
甚大。因此，课题组根据白诃颗粒中各药味性质
准确称取处方量药材3份，按优选的提取工 艺进行3次验证试验，结果干膏收率分别为30.31 %，30.17 %，30.36 %，白头翁皂苷B4提取量分 别为0.9567，0.9480，0.9507 g，二者RSD分别为 0.33 %，0.47 %，表明该工艺稳定可行，重现性 良好。 2.5 指纹图谱的建立
t/min A
t/min B
t/min C
A对照品； B供试品； C阴性对照
图1 白头翁皂苷B4含量测定HPLC图 2.1.5 方法学考察 线性关系考察其回归方程为 Y= 243 904X-7235.3（r=0.9999），白头翁皂苷 B4在0.684~7.120 μg范围内线性关系良好；精密 度试验表明，连续测定6次的RSD为0.95 % ；稳 定性试验结果表明0，2，4，8，12，24 h的RSD 为1.14 %；重复性试验表明，同一批6份样品中 白头翁皂苷B4含量的RSD为1.98 %。结果表明， 该方法符合测定要求。
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食品与药品 Food and Drug 2016年第 18卷第1期
2.1.6 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品
溶液各10 μL 注入液相色谱仪，依法测定，外标
法计算含量，即得。
2.2 出膏率的测定
精密量取已定容至2000 mL提取液20.0 mL，
置入已干燥至恒重的蒸发皿，水浴蒸干后于105
中图分类号： R284.2
文献标识码：A
文章编号：1672-979X（2016）01-0016-04
Study on Water Extraction Process of Baihe Granules Based on Orthogonal Design and Fingerprint
ZHANG Li-fei1, JIA Cheng-you1,2, LUO Xiang1, GAO Zi-ping1 (1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China; 2. Chongqing Academy of Chinese
鉴于传统汤剂煎煮、携带、服用不便，本 研究欲将汤剂研制成颗粒剂，在保持其综合疗效 的前提下，克服汤剂的不足[3]。研究以出膏率和 君药指标性成分白头翁皂苷B4综合评分为评价 指标，采用正交试验结合指纹图谱法优选白诃颗 粒的最佳水提工艺[4~6]，以期为白诃颗粒的工业 化制备奠定基础。 1 仪器与材料
白头翁汤出自汉代张仲景《伤寒论》，由 白头翁、黄连、黄柏、秦皮四味药物组成，具有 清热解毒，凉血止痢之功效，主治热痢下重，腹
痛里急，脓血杂下，肛门灼热，苔黄，脉弦数者 [1]。研究证实，白头翁汤对细菌性痢热痢、阿米 巴痢疾，慢性溃疡性结肠炎、结肠炎等疾病疗效
收稿日期：2015-08-06 作者简介: 张丽飞（1990-），女，河南驻马店人，硕士研究生，研究方向：中西医结合治疗皮肤病研究
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基于正交设计和指纹图谱法的白诃颗粒水提工艺研究
张丽飞1，贾成友1,2，罗祥1，高子平1*
（1. 成都中医药大学，四川 成都 611137；2. 重庆市中药研究院，重庆 400065）
摘 要：目的 优选白诃颗粒水提工艺，为该制剂的工业化生产提供参考。方法 以白头翁皂苷B4提取量和干膏
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2
2
2 23.88 0.7249 77.85
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3
3
3 28.10 0.8871 93.79
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1
2
3 29.12 0.8230 91.04
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1 29.92 0.9281 98.81
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2 19.27 0.5484 60.49
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2 28.74 0.9171 96.56
83
2
1
3 21.57 0.6510 70.08
93
3
2
1 29.69 0.9392 99.22
K1 71.143 76.463 57.453 78.940
K2 83.447 82.247 89.370 78.300
K3 88.620 85.500 96.387 84.970
R 17.477 8.037 38.934 6.670
表3 水提工艺方差分析
利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系 统》（2004A 版）软件，对不同提取工艺样品 HPLC色谱图进行叠加比较[7]，结果见图2。
S1～S9-不同提取工艺供试品 9-白头翁皂苷B4
图2 供试品HPLC指纹谱图 由图2可见，不同提取工艺样品共标定了10 个共有峰，各共有峰除峰面积大小有别外，出峰 时间无差异，说明该研究不同提取工艺对处方 中成分的提取无质的改变，仅量的差异改变。直 观分析可知，S9样品9号峰最大，S1样品9号峰 最小，说明S9样品中白头翁皂苷B4提取量值最 大，S1最小。其余样品9号峰分布二者中间，提 示不同提取工艺对白头翁皂苷B4提取量大小有 显著影响。S1，S4，S6，S9供试品提取工艺见 表4，具体分析将在讨论部分阐述。
℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，精
密称定重量，计算出膏率，出膏率=［浸膏重量
×100/药材重量］×100 %。
2.3 水提工艺优选
选择加水量（A）、煎煮时间（B）和煎
煮次数（C）为考察因素，每个因素设定3个水
平，以出膏率和白头翁皂苷B4提取量的综合评
分[OD=0.4W1/Wmax1+0.6W2/Wmax2]为评价指标优 化水提工艺[6]，因素水平见表1，正交试验安排
Waters-e 2695-2998高效液相色谱仪（美 国Waters公司）；CPA 225D型电子天平（十万 分之一，北京赛多利斯）；AW220型电子天平 （万分之一，日本岛津）；Millipore Synergy UV 型超纯水机（美国Millipore）.
药材饮片（白头翁系四川博仁药业有限责 任公司提供，其余药味系重庆慧远药业有限公司 提供）经鉴定为正品，符合中国药典2010年版 一部标准要求；白头翁皂苷B4对照品（批号： 111766-200601，中国食品药品检定研究院）； 乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；水为自制超 纯水；其余试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 白头翁皂苷B4的含量测定 2.1.1 色谱条件 色谱柱为Sapphire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） ；洗脱剂为乙腈-0.1 %磷 酸溶液（25∶75）；体积流量1.2 mL/min；柱温 30 ℃；检测波长为201 nm，进样量为10 μL，采 集时间为60 min。 2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取白头翁皂苷 B4对照品11.80 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇适 量使溶解，再加至刻度，摇匀，得贮备液。精 密量取贮备液4.0 mL置入10 mL量瓶，加甲醇至 刻度，摇匀，即得每1 mL含白头翁皂苷B4 0.472
及结果见表2，方差分析见表3。
表1 L9(34)正交试验设计因素水平表
水平
A /倍
因素 B /h
C /次
1
6
0.5
1
2
8
1.0
2
3
10
1.5
3
表2 L9(34) 正交试验安排及结果
试验 号A
因素 BC
D
评价指标 干膏收 白头翁皂 率/% 苷B4/g
综合 评分
11
1
1
1 15.71 0.3293 41.79
方差来源 离差平方和 自由度 F值
P
A
483.569
B
103.112
C
2583.712
注: F0. 05( 2, 2) = 19. 0
2
6.672 >0.05
2
1.423 >0.05
2
35.648 *<0.05
以综合评分为考察指标，根据表2中极差R 值大小，各因素对水工艺作用主次为C＞A＞B ＞D，以极值最小的因素D为误差项进行方差分 析，结果表明，因素C有显著性影响。结合生产 实际，确定最佳提取工艺为A2B2C3，即加8倍量 水回流提取3次，每次1.0 h。 2.4 验证试验
得率为综合评价指标，采用正交试验设计优化水提工艺参数，并建立指纹图谱印证白诃颗粒最佳水提工艺的
合理性。结果 水提制备工艺影响因素大小依次是：煎煮次数>加水量> 煎煮时间，最佳制备工艺条件为处方
药材加8倍量水，提取3次，每次1 h。结论 优选得到的工艺稳定可行，重复性好，可用于工业化生产。
关键词: 白诃颗粒；提取工艺；正交试验；指纹图谱；白头翁皂苷B4；出膏率
mg的对照品溶液。 2.1.3 供试品溶液的制备 按处方1的量称取87 g 药材，加水煎煮，滤过，合并滤液，定容至2000 mL。取供试液适量，12 000 r/min离心5 min，取 上清液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。 2.1.4 专属性检验 分别精密吸取供试品溶液、对 照品溶液与空白甲醇溶液各10 μL，注入液相相 色谱仪，记录色谱图，见图1。结果表明，阴性 对照溶液色谱图中与供试品在对照品峰相应保留 时间处未出色谱峰。
E-mail: 917123825@ *通讯作者: 高子平（1966-），女，教授，硕士研究生导师。研究方向：中西医结合治疗皮肤病研究
E-mail：gaoziping@
食品与药品 Food and Drug 2016年第 18卷第1期
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确切[2]。白诃汤是在白头翁汤和诃子散的基础上 加减马齿苋等药味组成，该方不仅保存了白头翁 汤清热解毒，凉血止痢之效，而且融合了诃子散 补敛肺气，止泻收脱之功，有效预防了滑泄不 禁，气虚欲脱现象的出现，临床止痢效果显著。
食品与药品 Food and Drug 2016年第 18卷第1期
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供试品 S1 S4 S6 S9
3 讨论
表4 不同供试品提取工艺
溶媒用量/倍 提取时间/min 提取次数/次
6
30
1
8
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2
8
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1
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提取工艺是制剂制备过程中很要的一个
环节，大量研究表明，提取工艺对制剂疗效影响
甚大。因此，课题组根据白诃颗粒中各药味性质
准确称取处方量药材3份，按优选的提取工 艺进行3次验证试验，结果干膏收率分别为30.31 %，30.17 %，30.36 %，白头翁皂苷B4提取量分 别为0.9567，0.9480，0.9507 g，二者RSD分别为 0.33 %，0.47 %，表明该工艺稳定可行，重现性 良好。 2.5 指纹图谱的建立
t/min A
t/min B
t/min C
A对照品； B供试品； C阴性对照
图1 白头翁皂苷B4含量测定HPLC图 2.1.5 方法学考察 线性关系考察其回归方程为 Y= 243 904X-7235.3（r=0.9999），白头翁皂苷 B4在0.684~7.120 μg范围内线性关系良好；精密 度试验表明，连续测定6次的RSD为0.95 % ；稳 定性试验结果表明0，2，4，8，12，24 h的RSD 为1.14 %；重复性试验表明，同一批6份样品中 白头翁皂苷B4含量的RSD为1.98 %。结果表明， 该方法符合测定要求。