N-乙酰半胱氨酸对槲皮素稳定性的影响及两者联合抗肿瘤活性评价

中国食品学报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
第20卷第6期2 0 2 0年6月
Vol. 20 No. 6Jun. 2 0 2 0
乙酰半胱氨酸对(皮素稳定性的影响 及两者联合抗肿瘤活性评价
王立峰1陈 琳1姚轶俊1李枝芳1王海鸥
(1南京财经大学食(科学与工程学-江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心南京210023
2
南京晓庄学-食(科学学-南京211171)
摘要为探究！-乙酰半胱氨酸(NAC )能否提高M 皮素在细胞培养液中的稳定性及两者联用能否产生更强的
抗肿瘤活性，本文用高效液相色谱定量M 皮素在培养液中的实时浓度,MTT 法评价M 皮素联合NAC 的体外抗
肿瘤效果$试验结果表明，M 皮素在细胞培养液中的降解符合一级降解动力学特征("2>0.95),降解常数#3与
M 皮素的初始浓度无关，与NAC 的浓度呈负相关,NAC 能提高M 皮素在培养液中的稳定性。

此外，M 皮素联合
NAC 对HepG-2、Caco-2、MKN-28和MDA-MB-231细胞的抗肿瘤活性均明显强于•各自作用时的抗肿瘤活 性，•中对HepG-2细胞的联合抗肿瘤活性™明显强于对•它3种细胞的联合抗肿瘤活性。

关键词 M 皮素；！-乙酰半胱氨酸；稳定性；抗肿瘤活性文章编号 1009-7848(2020)06-0019-08
doi ： 10.16429/j . 1009-7848.2020.06.003
懈皮素从洋葱、苹果、苦养、绿茶等食物中获 得CT ，是最常见的膳食类黄酮之一，同时具有优异 的抗肿瘤活性〔5旳,因此，把！皮素开发成高效的天
然抗肿瘤药物具有重大意义#虽然懈皮素的抗肿
瘤活性显著，但是，懈皮素的化学不稳定性和水溶 性差的特点还是明显限制了懈皮素的生物利用 率冋。

!-乙酰半胱氨酸(NAC )具有良好的水溶性和 抗氧化活性［9-10］，在食品领有
的应用
前景。

NAC 具有还性 ，可以中和未成对的
子，发挥高效的抗氧化作用［11］o 有研究表明NAC
可作为玉米在
中的抗氧化
剂， 抗氧化作用效果要强于BHA C12D 。

NAC 还 制果 的 和有 挥发物 酮、 乙
烯乙 的 问。

此,NAC 还作为 品的稳定，： 、 、果、
、
黄、
等$
收稿日期：2019-05-06
基金项目：国家重点研发计划(2017YFD0401202)；国家自
然科学基金面上项目(31571766)；江苏高校优
势学科建设工程资助项目(PAPD )
作者简介：王立峰(1977—),男，博士，教授通讯作者：王海鸥 E-mail : ***************
本研究基于懈皮素易被氧化和NAC 具有优 异抗氧化 的特点，
NAC 懈皮素在
细胞培养液中稳定性的影响，
懈皮素与
NAC 对HepG-2肝癌细胞、Caco-2结肠腺癌细 胞、MKN-28胃癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细
的联合抗肿瘤活性$
1材料与方法
1.1材料与试剂
!皮素，美国sigma 公司;！-乙酰半胱氨酸，
天生物 ；
， ；
HepG-2 、MKN-28
、MDA-MB-
231
、Caco-2 ，中国科学
院细胞库；MEM 培养基、1640培养基、DMEM 培
、 、0.25% 、
素-
素溶，
Gi3ico $
1.2仪器与设备
SpectraMax M2e 多功能酶标仪，美国分子仪 器 ；BB15 CO 2培养箱，美国Thermo Fisher 公 司；Agilent 1100 高效液相色谱 Agilent 1100
DAD 检测器、Agilent 1100 四兀泵、Agilent SB - C18 分析柱(5 |!m ，4.6 mm x 250 mm )，美国 Agi ­
lent 公司；FRQ-1006TH 小型超声波 洗机，杭州
20中国食品学报2020年第6期
法兰特超声波科技有限公司。

1.3试验方法
1.3.1储备液的配制
1）＜皮素储备液的配置准确称取＜皮素30.20mg,溶于1mL的DMSO中，-20#密封储存。

2）NAC储备液的配置准确称取NAC粉末81.60mg，溶于1mL的PBS溶液中,-20#密封储存。

1.3.2懈皮素含量的测定用高效液相色谱（HPLC）测定懈皮素在培养液中的浓度。

1）样品的制备将懈皮素储备液用培养液稀释至50,100,150,200,250^mol/L,或用分别含1,2,3,4,5mmol/L NAC的培养液将懈皮素储备液稀释至200!mol/L,置于CO2培养箱（37#）中降解,分别于0,05,2,4,6,8,10,12,14h取样，用HPLC测定懈皮素的浓度％培养液:DMEM培养基+0.1%青霉素-链霉素溶液+10%胎牛血清％2）高效液相色谱条件A相:超纯水,B相:甲醇；等度洗脱：23%A+77%B（15min）；检测波长380nm,进样量10“L,柱温30#，流速0.8 mL/min%
3）准曲线的绘制30.20mg＜皮素用甲醇分别稀释至50,100,150,200,250“mol/L。

以＜皮素浓度，，性回归，标准曲线方程为：!=31.178"+21.02,#2=
0.9906%
1.3.3细胞增殖抑制率的测定＜皮素和NAC 用培养液配制1的浓度用，DMSO 终浓度均定分数0.4%%将HepG-2、MKN-28、MDA-MB-231和Caco-2细胞分别铺于96，培养过夜后，将原培养液，分别
入表1的培养液200^L,
仅含0.4%的DMSO培养液,培养24h,将培养液弃去，用PBS清洗2次％120!L的1 mg/mL的MTT溶液，培养4h,弃去MTT溶液，每100!L DMSO,37#振荡20min,570nm 处测吸光度％HepG-2,Caco-2细胞培养液:DMEM 培养基+10%的胎牛血清+0.1%的青霉素-链霉素；NKN-28细胞培养液：1640培养基+10%的胎牛血清+0.1%的青霉素-链霉素；MDA-MB-231细胞培养液:MEM培养基+10%的胎牛血清+0.1%的青霉 素-链霉素%
表1.皮素(Que)和NAC的联合作用浓度
Table1The combined treatment concentration
of quercetin(Que)and NAC
Que/^mol•L-1NAC/mmol•L-1
00 2.557.510
250 2.557.510
500!.557.510
1000!.557.510
!000!.557.510
4000!.557.510
细胞增殖抑制率的计算公式：
细胞增殖抑制率/%=$1-$2$100（1）
$1
式中:$1--------------对照组的吸光度；$2---------------试验组的度%
1.3.4制浓度（IC50"和联合指数（CI）的计算利用软件Graphpad Prism8＜皮素、NAC单独作用的IC50（24h）值，以及同一浓度NAC浓度＜皮素用,＜皮素的IC50。

按公式（2）CI,懈皮素NAC 的性。

CI公式如下网：
CI=IC50&C1）.IC50&C2）（2）
C=IC50（1）IC50（2）（）
式中：IC50（1）和IC50（2）分别为药物1和药物2单独作用的细殖制效的浓度；IC50（C1）和IC50（C2）分别为两药物联用时,
殖制效1!
的浓度%
1.4数据处理
用件SPSS分,用平均值士准（mean士SD）,
至3；水平设置％＜0.05。

2结果与分析
2.1 .皮素降解动力学特征
1,浓度不同的懈皮素在培养液中的浓度&t都呈指数下降趋势。

因此,考虑将 分别零级，一级，二级降解动力学方程，明懈皮素的降解符级
第20卷第6期—-乙酰半胱氨酸对(皮素稳定性的影响及两者联合抗肿瘤活性评价
21
降解动力学特征。

因此,-皮素(Que )的降解过程 可作如下解释:
Que
也_> GP
t = 0 Co (Que ))Co
Co (GP )C * (Que ))C *
C * (GP ))C o
降解速率方程微分形式为：
')(C *(
Q ue )
)叽Ct (Que )
(3)
at at
用C *替代C t (Que ),化简为:
_(dt * = !obsC *
(4)
公式4不定式积分：
lnC *)—kobst + C*
(5 )
将lnC *对时间t 作直线图,斜率为—kobs ,这是
一级反应方程的重要特征,再对公式(5)作定积
分，可得公式6：
「鲁)!k obs dt
(6)
+o C *
o
积分可得公式7：
_"二—k obs t + C (7
)
C o
-皮素的初始浓度C o 和降解时间t 下的浓度 C *可以计算出k 血(表观速率常数),并用公式(7)
将试验数据进行拟合，结果表明ln (C */C o )W t 之间
存在良好的线性关系(,2>o.98) ( 2),以 '
不 始浓度的—皮素，它的降解 合一级降
解动力学特征&
图2可知，当—皮素的初始浓度从5o ixmol/L
增加到25o !mol/L ,k o bs 并不会随着—皮素 始浓
度的 而发生显著变化，这是一级降解反应的 一重要特征问& 此可知，-皮素的降解
:
期与 初始浓度 关,与kobs 关&因此,-皮素
在 的 降解是 定的 ， 如 kobs 是
-皮素稳定性的关键所在&
2.2 NAC 对"皮素降解速率的影响
从图3可知，在含有不同浓度NAC 的培养液
中，-皮素的浓度C *随时间t
数下降
化，进一 拟合图3的数据， 一级动力学 线
(图 4)，
关系数
o.95( 3)， 以 ln (C */
C o )和时间t 之间 在 好的线性关系&因此，-皮
素在不 NAC 浓度 下的降解 合一级降
解动力学特征&
从图5可，在不含NAC 的培养液中，—皮
素的 k obs 为(o.9434 土 0.072) h _1,而在含 1 mmol/L NAC 的
，—皮素的 k obs
为(o.5o21 土
o.o51) h _1, NAC 浓度 ，—皮素的 kobs^
小& NAC 的浓度达到5 mmol/L 时,—皮素的 %
则减小为(o.1711 土 o.o29) h _1
,降解时间也从4h
16 h &所以,NAC -皮素在
:
的降解速率， —皮素在
的
定性&
拟细胞在体内生存的生理环
境，是 生，进行 作
过
的
， 的 、
、
、维生素 ！ 明，-皮素在
的降解速度
在PBS 的降解速
度[16],
-皮素在
要发生化降
3oo -25。

"卜
15。

“ioo “5。

汁
°o
箕
5o |!mol/L ♦ ioo ^mol/L ▲ 15o pmol/L
■ 2oo ^mol/L • 25。

|!mol/L
1.o o.8g 0.6
'i
0.40.2
it
2
3时间/h
0 ----------------------------------------L 0 50 100 150 200 250
图1 "皮素在培养液中的浓度随时间变化散点图—皮素浓度©mol - L _1
图2初始浓度对"皮素在培养液中降解速率的影响
ITIOUl
腿蛭fc ^
w
45
Fig.1 Sca**er plo* of change in concen*ra*ion of querce*in in medium over *ime
Fig.2 Effec* of ini*ial concen*ra*ion on degrada*ion
ra*e of querce*in in cul*ure medium
1
22中国食品学报2020年第6期
表2不同初始浓度(皮素(Que)在培养中降解的
线性回归决定系数(!2)
Table2Linear regression coefficient of determination("2)of different initial concentrations of quercetin(Que)in the culture medium 表3(皮素(Que)在含NAC培养液中降解的
线性回归决定系数(!2)
Table3Linear regression coefficient of
determination("2)of quercetin(Que)
in cultrue medium containing NAC
!(Que)/!mol*L-1"2
500.9976
1000.9862
1500.9942
2000.9970
2500.9929NAC+200!mol/L Que"2 0mmol/L NAC0.9970 1mmol/L NAC0.9967 2mmol/L NAC0.9552 3mmol/L NAC0.9743 4mmol/L NAC0.9933 5mmol/L NAC0.9948
时
U T O E W 超秤*
里W 210
180
150
5mmol/L NAC■4mmol/L NAC
▲3mmol/L NAC M2mmol/L NAC
•1mmol/L NAC+0mmol/L NAC
120
90
60
o
’
；
-
1
2
3
-
-
-
(
M
8
U
-
101416
30
▲
、
X
■▲
t
♦
▲
2468
▲
0L
图3
246810121416
时间/h
(皮素在含NAC的培养液中的浓度
随时间变化散点图
Scatter plot of change in concentration
-5l\
'♦5mmol/L NAC■4mmol/L NAC
一6L▲3mmol/L NAC翼2mmol/L NAC
•1mmol/L NAC+0mmol/L NAC
图4(皮素在含NAC的培养液中的一级降解
动力学曲线
Fig.4First-order plots for degradation of quercetin
in culture medium containing NAC
Fig.3
of quercetin in culture medium containing
NAC over time
图5NAC浓度对(皮素降解速率的影响
Fig.5The effect of NAC on the degradation
rate of quercetin in the medium
解［7M。

这是因为，皮素B环的邻苯二酚结构是
良好的供氢体，是活性自由基最先攻击的部
位N13］；C环的共Q结构(C2=C3,C4=O)也易被活
性自由基进攻，形成稳定的，皮素酚氧自由基离
域N10］；C环3位的-OH则有助于,皮素被氧化后
形成更多共振结构使其更加稳定N20-21P$抗坏血酸
和半胱氨酸能有效抑制,皮素在pH8.0的磷酸
缓冲液中的分解㈤。

NAC作为一种强有效的抗氧
化，供H#离子，中和氧自由基:
抗氧化作［23］,也能抑制，皮素的氧
化解$，不管是理论还是实践均明,NAC
能，皮素的解，，皮素在细
液中的稳定性
$
第20卷第6期"-乙酰半胱氨酸对(皮素稳定性的影响及两者联合抗肿瘤活性评价
23
2.3 "皮素与NAC 的联合抗肿瘤活性
浓度搭配比例会影响两化合物联合作用的效
果㈣，图6给出了4皮素与NAC 联用对4种细胞
的增殖抑制作用，不同于4皮素的浓度单位为
!mol/L ,NAC 的浓度单位为mmol/L ,则NAC 对肿
瘤细胞具有较低的毒性作用。

当NAC 的浓度小于 等于5 mmol/L 时，其对4种肿瘤细胞几乎没有产
生毒性作用(细胞增殖抑制率小于10%)。

5 mmol/ L NAC 对 Caco-2、HepG-2、MKN-28 和 MDA- MB-231细胞的增殖抑制率分别为2.14% ±
0.56% ,3.89% ± 0.37% ,5.41% ± 0.73%和 2.25% ± 0.78% ,100 !mol/L 4皮素对 Caco-2%HepG-2%
MKN-28和MDA-MB-231细胞的增殖抑制率分 别为 30.17% ± 3.16% ,43.19% ± 4.23% ,30.22% ± 4.22%和 15.27% ± 2.13% ,但是 5 mmol/L NAC 联
合 100 !mol/L 4皮素对 Caco-2、HepG-2、MKN- 28和MDA-MB-231细胞的增殖抑制率分别增加
至 44.26% ± 3.41% ,70.26% ± 4.88% ,48.34% ± 3.38%和22.76% ± 3.40%。

因此，在NAC 不产生细
胞毒性的浓度范围内,NAC 能
4皮素对
4种肿瘤细胞的抗肿瘤活性$
4皮素联合其 性物 的 肿瘤 性
已较为 ,4皮素联合 对人体肠癌细胞
HuTu-80、Caco-2和乳腺癌细胞PMC42有协同抗
增殖作用㈣。

4皮素和10-— 喜 联用对 MCF-7%BGC-823和HepG-2肿瘤细胞均具有协
同抗增殖作用㈣。

4皮素与NAC 的联合 肿瘤
性 ， 对4皮素与NAC 的联
合抗肿瘤性 ，结果表4皮素联合
NAC 能产生强于其
作用时的抗肿瘤活性$
—♦—NAC 0 mmol/L —NAC 2.5 mmol/L —A —NAC 5 mmol/L ―X —NAC 7.5 mmol/L ―•—NAC 10 mmol/L
――NAC0mmol/L
—•— NAC 2.5 mmol/L —*— NAC 5 mmol/L ——NAC 7.5 mmol/L
—•—NAC 10mmol/L
o o
o
o o O
2 0 8 6 4 21 1爵駆晁®褻島W
(b )
50 100 150 200 250 300 350 400
4皮素浓度/!mol - L -1
120■ NAC 0 mmol/L
—■— NAC 2.5 mmol/L
100
—A — NAC 5 mmol/L
—NAC 7.5 mmol/L —•— NAC 10 mmol/L
80
604020
0 i ____I _____________I ____I ____L 0
50 100 150 200 250 300 350 400
4皮素浓度/|±mol • L -1
( a )
50 100 150 200 250 300 350 400
4皮素浓度/|Ji mol *L _1
(；)
-1 NAC 0 mmol/L —■— NAC 2.5 mmol/L ~*- NAC 5 mmol/L —NAC 7.5 mmol/L
―•— NAC 10 mmol/L
50 100 150 200 250 300 350 400
4皮素浓度/^mol-L -1
(c )
图 6 "皮素(Que )联合 NAC 对 Caco-2(a )s MKN-28(b )s HepG-2(c )s MDA-MB-231 (d )
4种肿瘤细胞的增殖抑制作用(平均值土标准差，！ = 3)
Fig.6 Antiproliferative effect of quercetin (Que ) combined with NAC on Caco-2 (a ),MKN-28 (b ),
HepG-2 (c ), MDA-MB-231 (d ) cancer cells (mean ±SD , n 二 3)
表4给出同一浓度NAC 与不同浓度4皮素 联用时,4皮素的半数抑制浓度(IC po )和两者的联
合指数(CI ),随着NAC 浓度的增加，4皮素的IC po
值呈快速下降的趋势$此外，4皮素与NAC
的联
24中国食品学报2020年第6期
表4NAC联合*皮素！Que"作用)4h,*皮素的半数抑制浓度(ICd以及两者的
联合指数！CI)(平均值土标准差，！=3)
Table4The IC5o of quercetin and combination index(CI)after cells treated with NAC combined
with quercetin(Que)for24h(mean土SD,&=3)
NAC0mmol•L-1 2.5mmol•L-15mmol•L-17.5mmol•L-110mmol•L-1 Caco-2Que:IC50/^mo b L-1154.26士3.82114.2士4.0298.02士3.7971.97土3.3738.47士2.98 CI 1.000.91士0.080.97士0.060.96士0.080.91士0.07 MKN-28Que:IC50/^mo b L-1167.4土4.27109.9士4.0290.93士3.2764.45士3.5339.98士3.02 CI 1.000.83士0.090.89士0.070.91士0.080.94士0.06 HepG-2Que:IC50/^mo b L-1116.5土3.2979.11士3.8146.98士3.1739.12土3.2426.55士2.26 CI 1.000.82士0.070.69士0.050.76士0.060.66士0.04 MDA-MB-231Que:IC50/^mo b L-1359.8士4.02310.6土3.81279.1士4.06203.3士3.79148.5士366 CI 1.000.98士0.07 1.02士0.090.93士0.080.90士0.07
合指数都基本小于1,表现出良好的联合效果,其中，＜皮素联合NAC对HepG-2细胞的联合指数CI整体小于其它3种细胞。

因此，在这4种肿瘤细胞中，＜皮素联合NAC对HepG-2细胞表现出最优的抗肿瘤活性。

3结论
在不含NAC的培养液中，＜皮素的！。

bs为(0.9434士0.072)h81，而当培养液中的NAC浓度从1mmol/L增加到5mmol/L时，＜皮素的从(0.5021士0.051)h81降低到(0.1711士0.029)h81。

因此，NAC能减小懈皮素在培养液中的降解速率，提高懈皮素在培养液中的稳定性。

另一方面，由CI值基本小于1可知，＜皮素联合NAC对HepG-2、Caco-2、MDA-MB-231和MKN-284种肿瘤细胞均表现出优于其各自作用时的抗肿瘤活性，其中＜皮素联合NAC对HepG-2细胞的抗肿瘤活性明显高于其它3种细胞。

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The Effect of!-acetylcysteine on the Stability of Quercetin and the Evaluation of Antitumor Activities for Quercetin Combined with!-acetylcysteine
Wang Lifeng1Chen Lin1Yao Yijun1Li Zhifang1Wang Haiou2*
(College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics,Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety,Nanjing210023
A School of Food Science,Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing211171)
Abstract In order to explore whether N-acetylcysteine(NAC)can improve the stability of quercetin in cell culture medium and whether quercetin combined with NAC can show stronger antitumor activity,the real-time concentration of quercetin in culture medium was determined by high performance liquid chromatography,and the degradation equation was fitted.Then the antitumor activity of quercetin combined with NAC in vitro was evaluated by MTT method.The re ­
26中国食品学报2020年第6期
suits showed that the degradation process of quercetin in cell culture medium accorded with the first-order kinetic char­acteristics(!2>0.95).The degradation constant k obs was independent of the quercetin#s initial concentration and negatively correlated with the NAC concentration.So NAC could improve the stability of quercetin in culture medium.In addition, quercetin combined with NAC showed stronger antitumor activity of HepG-2cells,MKN-28cells,MDA-MB-231cells and Caco-2cells than the single use of quercetin or NAC.Among these four cells,NAC combined with quercetin showed strongest antitumor activity of HepG-2cells.
Keywords quercetin；&-acetylcysteine；stability；antitumor activity
研究表明维生素K或有益老年人健康
参考消息网6月17日报道一项新的多种族研究发现，在为期13年的时间里，体内维生素K含量低的老年人与体内维生素K充足的老年人相比，死亡风险更高&研究人员说，这一研究结果表明，维生素K可能对老年人健康具有保护效果&维生素K是存在于绿叶蔬菜和植物油中的营养物质&
据美国每日科学网站6月15日报道，这项4000名年龄在54岁至76岁之间的美国人，其中三分之一不是人&这项研究由位于塔夫茨大学的让•马耶美国农业部人体营养老研究中心和塔夫茨学中的研究人员，发表于《美国营养学》月刊&
研究中维生素K含参与者分组&然后，他们对比了长达13年的跟踪研究期间各组参与者的心脏病发病风险和死亡风险&
研究结果表明，维生素K含量与心脏病风险之间没有明显关联&然而，维生素K含量最低的人群的死亡风险比维生素K摄入充足的人群高19%&
维生素K是维护康的重要营养物质&它存在于生菜、羽衣甘蓝、菠菜等绿叶蔬菜中，也存在于豆油和菜子油等某些植物油中&
研究报第一作者凯拉•谢伊说：“我们知道，血管组织中的蛋白质要发挥作用就需要维生素K,而维生素K可能与心脏病和死亡有这一于这种&中的质有于中的&果有足够的维生素K,这些蛋白质发&”
报道绍，是人体营养老研究中心维生素K团队中的科学家/这个团队在有关维生素K预防慢性病的研究方面威望素着&研究报共同、人体营养老研究中心主任萨+布思开发了测中维生素K含的方&她的测研究对象的维生素K水平，并将继续生人口研究中维生素K情况的数据&研究报告的另一位，塔夫茨学中肾专家丹尼尔•韦纳说：“像一根橡皮筋老失去弹性一样，当静脉和时，泵效会降低，进致多种并发症&这是为什么在像这样的研究中，衡量死亡风险可以更好地确定哪些情况与康状况恶有&”
尽管这项研究在现有证据础上进一步证明维生素K可能有保护健康的效果，但它不能在维生素K含量低和死亡风险之间建立因果系，因为这项研究属于观测性质&还需要额外的研究来阐明为什么血液中维生素K的含量与死亡风险是有&
报道称，这项研究是一项整合分析，合并了三项正在进行的研究中的数据&这三项研究分别是“健康、老龄化和身体成分研究”，“多种族粥样硬化研究”和“弗雷明研究”&这项研究的参与者都是在测量体内维生素K水平的，是在同一个（人体营养老研究中维生素K实验室）的同一测中的，目的是于的&测中维生素K1的含&
释剂华法林的参与者被排除在外，因为维生素K与华法林的抗凝血效果产生反应&所有参与者在实验开始时有，并在一次体中测维生素K的水平，这是每一项研究的一&
对年、性别、人种、种族、身体质数、油、水平、情况以高血压用药等因素进行&
报道指出，这项研究存在一些局限性，包括血液中维生素K1含量仅取自一次抽血的测量结果，而不是前后多次验血&维生素K1含高可能体上反映出更好的和生&，与总死亡数相比，参与中有的情况，这可能研究人员识别具有学的风险的能力&（消息来源：参考消息网）。