第五章 分子生物学研究法(2)-克隆载体
分子克隆
2
第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
3
第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
40
第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
1
第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
29
第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
5第五讲分子克隆载体
黏粒载体(cosmid vector)
基本特征： 1 是质粒的衍生物，是带有cos位点的质粒。 2 其组成有质粒的复制起点(ColE1)、抗性基
因、cos位点、MCS。 3 大小为5～7kb 4 能克隆的外源DNA片段最大达40kb。
黏粒载体的特点：
（1）具有λ 噬菌体的特性（但因不含λ 噬菌 体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周 期，无法形成子代噬菌体颗粒）；
质粒的存在形式：
一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
质粒DNA的大小
质粒
宿主
pPbs
蓝藻
CoLE1
大肠杆菌
PV21
三叶草根瘤菌
多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
质粒的基本性质： 1 复制
利用染色体的复制功能来驱动外源DNA片段 复制的载体。
1 酵母人工染色体载体(YAC) 2 细菌人工染色体载体(BAC)
酵母人工染色体载体(YAC)
利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。 复制的必须元件：
作为克隆载体的DNA分子具备的条件：
1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞；
2 能在宿主细胞中自主复制，一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）；
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因；
5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
MCS
lacZ`
Ampr Ori
含四个部分：
（1）来自pBR322的质粒 复制起点（ori）；
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
2013-2014分子生物学章节练习题第5-6章练习题
第五、六章分子生物学研究方法练习题1一、【单项选择题】1.一般的限制性核酸内切酶II作用的特点不包括A.在对称序列处切开DNAB.DNA两链的切点常不在同一位点C.酶切后产生的DNA片段多半具有粘性末端D. DNA两链的切点常在同一位点，E.酶辨认的碱基一般为4-6个4.下列关于建立cDNA文库的叙述哪项是错误的A.从特定组织或细胞中提取mRNAB.将特定细胞的DNA用限制性核酸内切酶切割后，克隆到噬菌体或质粒中,C.用逆转录酶合成mRNA的对应单股DNAD.用DNA聚合酶，以单股DNA为模板合成双链DNA5.限制性核酸内切酶的通常识别序列是A.粘性末端B.RNA聚合酶附着点C.回文对称序列,D.多聚腺苷酸E.甲基化的“帽”结构9.基因工程的操作程序可简单地概括为A.载体和目的基因的分离、提纯与鉴定B.分、切、连、转、筛，C.将重组体导入宿主细胞，筛选出含目的基因的菌株D.将载体和目的基因接合成重组体E.限制性核酸内切酶的应用11.常用质粒有以下特征A.是线性双链DNAB.插入片段的容量比λ噬菌体DNA大C.含有抗生素抗性基因，D.含有同一限制性核酸内切酶的多个切口E.不随细菌繁殖而进行自我复制14.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是A.大肠杆菌表达体系B.原核表达体系C.酵母表达体系D.昆虫E.哺乳类细胞表达体系，18.在分子生物学上“重组DNA技术”又称为A.酶工程B.蛋白质工程C.细胞工程D.发酵工程E.分子克隆技术22.基因组代表一个细胞或生物的A.部分遗传信息B.整套遗传信息，C.可转录基因D.非转录基因E.可表达基因25.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A.化学合成法B.基因组文库法C.cDNA文库法D.PCRE.差异显示法27.PCR主要的酶是A.DNA连接酶B.反转录酶C.末端转移酶D.碱性磷酸酶E. Taq DNA聚合酶28.重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶A.DNA聚合酶B.RNA聚合酶C.DNA连接酶D.RNA连接酶E.限制性核酸内切酶30.最常用的筛选转化细菌是否含重组质粒的方法是A.营养互补筛选B.抗药性筛选，C.免疫化学筛选D.PCR筛选E.分子杂交筛选33.用于重组DNA的限制性核酸内切酶，识别核苷酸序列的A.正超螺旋结构B.负超螺旋结构C.α-螺旋结构D.回文结构，E.锌指结构58、基因治疗是指A．对有基因缺陷的细胞进行修复，从而使其恢复正常，达到治疗疾病的目的B．把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的C．运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变恢复正常D．运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的93．PCR实验的特异性主要取决于A．DNA聚合酶的种类B．反应体系中模板DNA的量C．引物序列的结构和长度D．四种dNTP的浓度E．循环周期的次数94．基因剔除（knock out）的方法主要被用来研究A．基因的结构B．基因的功能C．基因的表达D．基因的调控E．基因的突变95．反义核酸作用主要是A．封闭DNA B．封闭RNAC．降解DNA D．降解DNA E．封闭核糖体的功能105. 酵母单杂交技术是分析【】的实验系统。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
分子生物学实验技术-2-基因的克隆
分子生物学实验技术二、基因的克隆（一）DNA片断与载体的连接本实验做PCR回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。
TA克隆原理：利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要用于PCR产物的克隆和测序。
实验安排：每人做一管。
反应体系（10μl）：Ligation Solution I 5 μLPCR回收产物 4.5 μLpMD-18T vector 0.5 μL总体积10 μL反应条件：16℃ 4 h以上（二）感受态细胞的制备实验安排：每人做一管。
试剂配制：1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10 g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 10 g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1 L，高压下蒸气灭菌20 min。
2、0.1 mol/L CaCl2溶液：称取1.11 g CaCl2（无水，分析纯），溶于超纯水中，定容至100 mL，高压灭菌或0.22 μm滤膜过滤除菌。
3、无菌甘油：取甘油100 mL，高压灭菌即可。
操作步骤（无菌操作）：1、从生长有大肠杆菌DH5α的平板上挑取一个单菌落，接种于2 mL LB液体培养基中，37℃200 r/min振荡培养过夜，作为一级种子。
2、将一级种子按1:50比例无菌转接到5 mL LB液体培养基中，37℃200 r/min振荡培养约2-3 h，至细菌的OD600达到0.5左右。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的1.5mL Ep管中，冰浴30 min。
4、4℃4000 r/min离心10 min，弃上清。
5、加入1 mL冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，继续冰浴15-30 min。
分子克隆载体 ppt讲义转pdf
UUUU...…
RNApol RNA pol
5¢ 5 ¢ 3¢ 3 ¢ 3¢ 3 ¢ 5¢ 5 ¢
5´pppG 5
茎环结构使转录终止的机理 茎环结构使转录终止的机理
一、pBR322
调控序列
增强子 启动子
结构基因
UAS 酵母
TATA
核糖体结合位点（S-D序列）
mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列 (Shine-Dalgarno)，又称为核糖体结合点。
3’… A CACUAGG…5’ 16sRNA U C U-C-C-U 5’……A G G A PuPuUUUPuPu…AUG mRNA
表达体系的发展
表达体
第一代 原核生物表达体系 第二代 酵母表达体系 第三代 哺乳类细胞表达体系 第四代 基因直接导入
载体
质粒、噬菌体 穿梭质粒 病毒、脂质体 DNA本身
宿主
细菌 酵母 培养细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。 基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结 合等组成的表达体系的调控。 基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修 饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知 识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
P
O
Z Y X
诱导物 诱导物
乳糖(或IPTG)
P O
Z Y X
Am
lacZ
N H 2
COOH
a片段 片段
w片段 片段
lacZ
标志补救（ß-半乳糖苷酶法） ß 半乳糖苷酶法）
分子生物学 基因克隆
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction, PCR
体外高效特异性的扩增目的DNA片段
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口 （blunt end）
G +GATCC
CCTAG
G
黏端切口 （sticky end）LOGO
粘性末端又可分为两种：
1）5-端突出
5 ………GAATTC………3 3 …… CTTAAG……… 5
EcoRI
5………GOH
5- AATTC……. 3
3………CTTAA -5
LOGO
用带有标记的、已知序列的核酸片段 (单链 RNA或DNA)作为探针，与待测DNA或RNA
样品进行核酸分子杂交，来检测被测样品中 是否有与探针序列同源的目标序列，以及目 标序列的量。
LOGO
转膜、 变性、 封闭、 加入变性的探针、 杂交、 洗涤、 检测杂交体。
LOGO
如何实现特异性的获得目的基因？
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 两条核苷酸链中，从5’到3’方向的核苷酸序列完全一致
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端
HindⅡ
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理基本原理克隆开始前至少需要两个重要的DNA分子。
首先，您需要要克隆的DNA片段，也称为插入片段。
它可以来自原核，真核，灭绝的生物，也可以在实验室中人工创造。
通过使用分子克隆，我们可以更多地了解特定基因的功能。
其次，你需要一个矢量。
载体是用作分子生物学工具的质粒DNA，用于制备更多拷贝或从某种基因产生蛋白质。
质粒是载体的一个例子，是由细菌复制的圆形，染色体外的DNA。
质粒通常具有多克隆位点或MCS，该区域含有不同限制性内切核酸酶的识别位点，也称为限制酶。
可以通过称为连接的技术将不同的插入物掺入质粒中。
载体质粒还含有复制起点，使其可以在细菌中复制。
另外，质粒具有抗生素基因。
如果细菌整合了质粒，它将在含有抗生素的培养基中存活。
这允许选择已经成功转化的细菌。
将插入物和载体克隆到宿主细胞的生物体中，最常用于分子克隆的是大肠杆菌。
大肠杆菌生长迅速，可广泛获得并且具有许多可商购的不同克隆载体。
真核生物，如酵母，也可用作载体生物。
一般分子克隆方法的第一步是获得所需的插入物，其可以来自任何细胞类型的DNA或mRNA。
然后根据插入物的类型选择最佳载体及其宿主生物，最终将用它完成。
聚合酶链式反应或基于PCR的方法通常用于复制插入物。
然后，使用一系列酶促反应，将消化插入物连接在一起并引入宿主生物体中以进行大量复制。
从细菌中纯化重复的载体，并在限制性消化后，在凝胶上分析。
然后将在凝胶上纯化的片段送去测序以验证该奖章是所需的DNA片段。
操作过程(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA 片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。
(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。
在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。
克隆载体课件
装到噬菌体颗粒中，以实行对大肠杆菌非常有效的侵染。 噬菌斑的形成：将λ侵染的细胞分布在未被侵染的大肠杆菌菌苔中会形成噬菌斑，是由 于侵染和细胞裂解循环而抑制了细胞生长的区域。 λ溶原体：利用λ噬菌的溶原生长期将克隆基因整合进大肠杆菌基因组，以使其长期表达。 溶原体 样操作双链环状M13NDA，但产生的噬菌体颗粒内仅含有环状ssDNA。 克隆到M13：用标准质粒克隆方法将重组DNA整合到M13载体，重组的M13DNA侵染敏 克隆到 感性大肠杆菌细胞，并形成生长缓慢的噬菌斑，然后从纯培养基中的噬菌体颗粒中分离出 ssDNA。 质粒－ 质粒－M13杂合载体：在辅助噬菌体帮助下，对宿主细胞的侵染，可诱导含有M13复 杂合载体 制起点的质粒形成单链噬菌体颗粒。
连接产物
将目的片段与质粒载体连接时，最常见的非目标产物就是 线性载体片段自身环化所形成的空质粒载体。自环化载体 可通过从转化克隆中小量提取质粒，然后酶解及随后的琼 脂糖凝胶电泳分析的方法来与重组体相区分，但用此法进 行大规模筛选是极不方便的，目前已开发出更有效的、便 于筛选的一系列载体。
双抗生素抗性
λ溶原体
λ 感染的溶原期也被克隆技术所利用。通过 含有目的序列的λ载体的整合作用可将基因或 外原序列整合进大肠杆菌基因组，这种基本 上是永久性的。该方法应用例子之一就是用 T7系统来过量表达蛋白质的菌株。含有Lac 启动子控制下的T7RNA聚合酶基因的菌株 BL21及其衍生物，作为λ溶原菌被命名为 DE3.该基因可被IPTG诱导，然后聚合酶将转 录出表达载体上的目的基因。
已克隆位点
因为在pUC载体上与克隆片段的插入位点相邻处有 一个启动子，很容易想象这样的启动子可用来转录 DNA，无论是在体外产生用作杂交探针的RNA转录 物，还是表达插入片段内基因的蛋白质产物，都不 成问题。 目前已构建了多种 转录型载体，以便开在体外进行 克隆片段的转录。例如，pGEM系列载体中就含有 来自噬菌体T7和SP6的启动子，两启动子间是MCS。 来自噬菌体的启动子只能被各自相应的噬菌体RNA 聚合酶所识别，上述两启动子中的任一种均可用于 体外转录克隆片段 的目的链。
第五章分子生物学研究方法20220313230.pptx
❖跨越天然物种屏障、把来自任何生 物的基因置于毫无亲缘关系的新的 寄主生物细胞之中的能力，是基因 工程技术区别于其他技术的根本特 征。本章将在回顾重组DNA技术史 上主要事件的基础上，讨论DNA操 作技术、基因克隆的常用载体系统 以及基因的分离与鉴定等3个环节。
5·1 重组DNA技术史上的重大事件
❖ 他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不 同来源的DNA片段能通过粘性末端之间 碱基互补作用而彼此“粘合”起来。
❖ 此后，大量类似于EroRl但具有独特识 别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目 前为止，科学家已经几乎能随心所欲地 把任何DNA分子切割成一系列不连续的 片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段 按照分子量大小逐一分开，以供下一步 研究。
❖ DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列 分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的 产生和发展。
❖ 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和 DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。 这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史 上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特 定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实 验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别 GAAUC序列，将DNA在这个位点切开产生 具有粘性末端的小片段。
第五章 分子生物学研究方法
❖ 2·琼脂糖凝胶电泳 ❖ 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂
糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成 良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔 点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化， 常用于DNA片段的制备电泳。
浙江大学分子生物学课件(载体的类型、克隆)
Z
Y
X
-互补原理
载体上带有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序 列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这 个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏 lacZ的阅读框架，不影响其正常功能，E.coli 受体菌 株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各 自独立的情况下，载体和受体菌中的-半乳糖苷酶 的片段都没有酶活性。但在载体和受体菌融为一体 时可形成具有酶活性的蛋白质。 这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与 带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突 变体之间可以实现互补的现象叫-互补。
插 入 失 活
插入失活
无DNA插入
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r
Tc s
外源DNA
Amp r Tcr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
Amp r Tc s
重组DNA
2、Байду номын сангаасUC18/19
在80年代初期，Messing等人在pBR322基础上构建了另 外一个pUC系列质粒载体。这个系列的载体与pBR系列载 体相比不同三个显著特点： （1）分子量更小，仅为2686 bp ，容纳外源DNA量增 • 大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 • （2）另一个标记基因是β-半乳糖苷酶基因(LacZa )，该 基因是一个生化标记基因，可利用-互补原理进行蓝白筛 选，极易检测。 • （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切 位点构成。共有10个克隆位点，极有利于克隆外源基因 •
•
2. pUC 18/19
第五章分子生物学研究方法演示文稿
PCR amplifies DNAs by repeated rounds of DNA replication in vitro.
模板（Template）
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶
抑制剂、DNA结合蛋白类。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 可以是复杂样品。
引物（primers)
引物是人工合成的两 段寡核苷酸序列，一 个引物与感兴趣区域 一端的一条DNA模 板链互补，另一个引 物与感兴趣区域另一 端的另一条DNA模 板链互补。
用下， 氢键断裂，形成单链DNA 。
退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物
与DNA模板结合，形成局部双链。
延伸（70℃-75℃）： 在Taq酶的作用下，
以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸， 合成与模板互补的DNA链 。
PCR反应程序
95℃ 5 min 95℃ 30 S 55℃ 30 S 72℃ 1 min 72℃ 10 min 4℃
PCR的原理
是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸 存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶 促合反应，将待扩增的DNA片段与其两 侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变 性——低温退火——引物延伸”三步反 应的多次循环，使DNA片段在数量上呈 指数增加，从而在短时间内获得我们所 需的大量的特定基因片段。
PCR的基本原理
第五章分子生物学研究方法演 示文稿
1
优选第五章分子生物学研究方 法
2
05第五章外源基因的克隆与表达
第五章外源基因的克隆与表达基因克隆技术即把来自不同生物的基因同有自主复制能力的克隆载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去扩增表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
通过基因克隆技术，就可以得到大量的目的基因并保存。
如果需要对目的基因的表达产物进行研究，还可以将目的基因和表达载体进行连接重组，将携带有目的基因的表达载体DNA导入宿主细胞内，利用宿主细胞内的环境和各种调控元件合成目的基因的表达产物。
构建新的重组DNA是基因克隆技术的关键步骤，一般重组DNA实验通常遵循以下程序∶分、切、连、转、选。
"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括具有携带连接外源DNA作用的载体DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成一种新的重组DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
第一节DNA片段的体外连接DNA片段的体外连接即构建重组DNA程序中的"连"，是DNA分子之间的连接过程，就是将目的基因通过重组到合适的载体上，导入适当的宿主细胞中实现增殖表达。
在连接的过程中需要DNA连接酶的作用，DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3＇羟基末端与5＇磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。
目前用于试管中连接DNA片段的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶（又称T4DNA连接酶）。
E.coli DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA片段平末端之间的连接。
T4 DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间的连接效率比较低。
克隆与表达重组蛋白的分子生物学方法与应用
克隆与表达重组蛋白的分子生物学方法与应用近年来，随着基因工程和生物技术的发展，克隆与表达重组蛋白的分子生物学方法已经成为了现代生命科学领域中的重要研究手段。
通过对基因进行克隆和表达，科学家们可以获得大量的重组蛋白，从而深入研究其结构、功能以及在疾病治疗和工业生产中的应用。
本文将介绍克隆与表达重组蛋白的一些常用分子生物学方法及其应用。
一、DNA 克隆方法1. PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的DNA扩增技术，它利用DNA聚合酶在适当的温度下，在DNA模板上合成新的DNA链。
通过PCR，科学家们可以在短时间内扩增特定的DNA片段，为后续克隆提供充足的模板。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列，生成黏性末端或平滑末端。
科学家们可以利用限制性内切酶将目标基因和载体进行切割，然后通过连接酶将它们连接起来，形成重组DNA。
3. DNA连接DNA连接是将两个DNA分子连接在一起，形成一个新的DNA分子。
通过DNA连接酶的作用，科学家们可以将目标基因与载体连接起来，构建重组DNA。
二、基因表达方法1. 原核系统表达原核系统表达一般采用大肠杆菌作为宿主细胞，通过转化重组质粒来实现外源基因的表达。
科学家们可以通过克隆将目标基因插入到表达载体（如pET系统）中，经过诱导后，宿主菌会产生大量的重组蛋白。
2. 酵母表达系统酵母表达系统是利用酵母细胞进行目标蛋白表达的一种方法。
这种系统具有优秀的蛋白质折叠和翻译后修饰能力，被广泛用于高效表达真核细胞外蛋白。
3. 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统可以用于表达复杂的重组蛋白，如糖蛋白和免疫球蛋白等。
这种系统利用昆虫细胞的优秀蛋白翻译和修饰能力，在较短时间内获得高表达水平的重组蛋白。
三、重组蛋白的应用1. 生物学研究重组蛋白可以在生物学研究中起到重要作用。
科学家们可以通过表达重组蛋白来研究其结构、功能以及与其他分子的相互作用关系，从而深入了解生物体内的生物过程和机制。
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第五章 分子生物学研究法
编码性状
二. 基因克隆的主要载体系统
野生型的质粒 DNA 上往往携带一个或多个遗传标记基因， 这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。
物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物； 物质合成：细菌毒素、有机碱。
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
噬菌体 烈性噬菌体
子代噬菌体
大肠杆菌细胞
温和噬菌体 噬菌体DNA整合到 宿主染色体DNA中
图: 噬菌体溶菌和溶源的繁殖方法
第五章 分子生物学研究法
（1） 噬菌体载体的特点:
二. 基因克隆的主要载体系统
① 可容纳较大的外源DN入细菌细胞容易, 不象质粒载体需 要采用特殊的导入法才能进入宿主细胞
③ 由于能裂解宿主细胞, 所以提取载体DNA或重组 DNA产物都比较容易
第五章 分子生物学研究法
(2) 噬菌体载体的种类
二. 基因克隆的主要载体系统
根据外源DNA进入载体的方式可分为: ① 插入型载体 插入位点 体外包装
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
2) 噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒的总称 可以用作为基因克隆载体
第五章 分子生物学研究法
• 噬菌体DNA的特点
二. 基因克隆的主要载体系统
- 噬菌体是一种双链的DNA病毒, 大小约50kb, 在噬菌 体颗粒中它是以线性形式存在 - 线性分子的5’端有一个由12个核苷酸组成 (5’GGGCGGCGACCT---3’) 的突出的粘性末端
载体带有大肠杆菌的 lac Z’基因
因此对重组子可通过蓝白斑筛选法进行筛选
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
② 取代型载体 当外源DNA插入时，一对克隆位点间的基因组DNA被替 换（取代），从而丧失某些生物学功能，造成重组子与
空载体形成噬菌斑形态（清晰和混浊）或颜色（蓝白菌落）
取代型载体
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
3) 柯斯质粒载体 (Cosimid) “ Cosmid” 一词是由英文“ cos site-carrying plasmid”缩写 而成的， 原意是指带有粘性末端位点的质粒。 是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的 特殊类型的质粒载体。
X-Gal （5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷) 检测试剂
第五章 分子生物学研究法
筛选原理：
二. 基因克隆的主要载体系统
质粒上的lacZ’在IPTG的诱导下表达产生-半乳糖苷酶的 亚基 宿主细胞产生的-半乳糖苷酶的 亚基 亚基 + 亚基 这种互补现象被称之为 -互补 具有催化活性的-半乳糖苷酶
板上就会形成白色菌落。
在同一平板上出现的蓝色菌落就是没有外源DNA插入的 原质粒载体。
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
③ 穿梭质粒载体 (shuttle plasmid vector) 穿梭质粒载体: 是一类由人工构建的具有两种不同复制起 点和选择标记, 因而可在两种不同类型的寄 主细胞中存在和复制的质粒载体。 常见的有: 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体； 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体。
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal,无色)
蓝色化合物
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
当把外源基因插入到任何一个克隆位点后, 破坏了-半乳
糖苷酶基因lacZ’ 的编码序列, 导致lacZ’基因失活。
转化细胞在加有氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的培养基平
第五章 分子生物学研究法
基因克隆载体 :
二. 基因克隆的主要载体系统
能够装载外源DNA片段或基因, 将它转入受体细胞后, 使外源基因能够在受体细胞中进行复制或表达的DNA分子 称为基因克隆载体。
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
作为基因克隆载体的DNA分子应具备以下基本结构:
至少有1个克隆位点, 供外源的DNA片段插入到克隆载体上。 至少有1个复制起点, 使携带的外源DNA片段进入到宿主细 胞中能够进行自我复制, 或者外源的DNA片段能够整合到 宿主的染色体中随着染色体DNA复制而复制, 并通过细胞 分裂传递给子代。 至少有1个遗传标记基因, 以指示载体或重组DNA分子是否 进入宿主细胞, 如抗生素标记。 较小分子量, 较高拷贝数。
第五章 分子生物学研究法
1. 基因克隆载体的种类 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 (cosmid) 噬菌粒载体
二. 基因克隆的主要载体系统
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
1) 质粒载体 质粒: 存在于细胞染色体外的, 具有自主复制能力的共价闭 合环形的双链DNA分子。一个质粒就是一个DNA分子。 细菌、藻类和酵母中都发现有质粒的存在。在己知的质 粒中除了酵母中的杀伤质粒 (killer plasmid)是RNA质粒之外, 其它的都属于DNA质粒。 质粒载体: 能够装载外源DNA片段的质粒DNA分子。
第五章 分子生物学研究法
可转移性
二. 基因克隆的主要载体系统
有些质粒DNA含有tra基因, 这一类型的质粒能够指令 宿主细胞(如大肠杆菌)产生菌毛, 合成表面活性物质, 促使宿 主细胞与受体细胞相结合, 从而使遗传物质从宿主细胞向受 体细胞中转移。 含有tra基因的质粒常称为接合质粒。
在基因工程操作中通常使用的是非接合型的质粒载体。
第五章 分子生物学研究法
（1）质粒载体的生物学特点: 自主复制
二. 基因克隆的主要载体系统
质粒是宿主细胞中能够自我复制的遗传单元。 质粒DNA分子在宿主细胞内的复制, 按质粒的拷贝数 的多少可分为严紧型和松驰型两大类型。
质粒拷贝数 通常是指生长在标准的培养基条件下， 每个大肠杆菌细胞平均含有的质粒DNA 的分子数。
该菌株带有-半乳糖苷酶C端部分编码序列, 它编码-半乳糖 苷酶的 亚基。
转化 pUC18 / 19 质粒
E.coli DH5
第五章 分子生物学研究法
蓝白斑选择法：
二. 基因克隆的主要载体系统
重组子在含有 IPTG、X-Gal和氨苄青霉素培养基上 进行筛选 IPTG （异丙基- -D-硫代半乳糖苷) 诱导剂
差别，这种差别即可作为筛选标记。
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
这两类λ噬菌体载体具有不同的特点，在基因克隆中的用途 也不尽相同。 插入型载体 只能容纳较小分子的外源DNA片段（一般在 10kb以内），广泛用于cDNA及小片段DNA 的克隆。 可容纳较大分子的外源DNA片段。
能在Amp平板上生长、但在 Amp和Tc平板上不生长的菌落 即为重组子。
挑选
影印
Ap + Tc
第五章 分子生物学研究法
② pUC18/19质粒载体
二. 基因克隆的主要载体系统
组成部分: - 复制起点 (ori)
MCS区
pUC19 2686bp
- 氨苄青霉素抗性基因 (Ampr) - 大肠杆菌-半乳糖苷酶基因 (lacZ)的调控序列和该酶N 端146个氨基酸的编码序列 （α亚基）。 - 在lacZ’ 基因编码区中插入 了1个多克隆位点（Multiple
无色的X-Gal 降解为一种蓝色化合物 （在培养基上形成蓝色菌落）
第五章 分子生物学研究法
pUC18 / 19：
Plac MCS pUC18/19
寄主细胞
二. 基因克隆的主要载体系统
lacZ’
CH 2OH O HO H O OH H H H H OH N Cl Br
Br
-半乳糖苷酶的亚基
Cl O N N Br Cl
- 当噬菌体侵入宿主细胞后, 线性的DNA分子的两粘性 末端互补, 随后在DNA连接酶的作用下, 形成环状分子
- 两粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点。
第五章 分子生物学研究法
噬菌体的类型
二. 基因克隆的主要载体系统
溶菌周期 在溶菌周期, 噬菌体将其感染的寄主细胞转变为 噬菌体的“制造厂”, 生产出大量的子代噬菌体颗粒。这 种 噬菌体被称之为烈性噬菌体。 溶源周期 溶源周期类型的噬菌体在感染寄主细胞的过程 中没有子代噬菌体颗粒的产生, 只是噬菌体的DNA被整合 到寄主细胞染色体中, 成为它的一个组成部分。这种 噬菌 体被称之为温和噬菌体。
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
严紧型质粒 (low copy number plasmid) 在每一个细胞中 的拷贝数在10和10以下。
松驰型质粒 (high copy number plasmid）在每一个细胞 中的拷贝数在 10以上。
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
抗药性筛选法
筛选重组子与非重组子的基本原理： 将外源DNA片段插在EcoRI位点： Pvu I Pst I r r 非重组子呈 Ap 、Tc 重组子呈 Apr、Tcr
EcoR I Cla I Hind III Pst I
BamH I Apr Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I
外源片段插在BamHI和Sal I位点： 非重组子呈 重组子呈 Apr、Tcr Apr、Tcs
ori
Bal I
Hind II
第五章 分子生物学研究法
二. 基因克隆的主要载体系统
抗药性筛选法的基本操作
Ap