七项呼吸道病毒检测试剂盒(鉴定)使用说明书

七项呼吸道病毒检测试剂盒（鉴定）使用说明书
【产品名称】
通用名称：七项呼吸道病毒检测试剂盒
英文名称：D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screen & ID Kit
【包装规格】
鉴定试剂：80人份/盒
【预期用途】
用于临床定性检测7种呼吸道病毒：甲型（A型）流感病毒，乙型（B型）流感病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒，副流感病毒1、2和3型。

【检验原理】
荧光素（FITC）标记的单克隆抗体与病毒抗原结合，形成稳定的抗原-抗体复合物，在荧光显微镜下观察，呈现特异性绿色荧光。

【主要组成成份】
组份名称规格主要成分
1 DFA染色试剂鉴定试剂流感A试剂：
2 mL
每试剂瓶为一项与病毒
抗原相对应的荧光单克
隆抗体
流感B试剂：2 mL
腺病毒试剂：2 mL
呼吸道合胞病毒试剂：2 mL
副流感1试剂：2 mL
副流感2试剂：2 mL
副流感3试剂：2 mL
2 40X浓缩洗液25 mL PBS
3 固定液15 mL 甘油
4 阳性质控板5块包被病毒抗原
【储存条件及有效期】
2ºC-8ºC避光保存18个月。

【适用仪器】
荧光显微镜，激发波长490 nm，发射波长520 nm。

【样本要求】
鼻咽部取样后保存于生理盐水中，应在24小时内送检。

【检验方法】
1、取样：用鼻咽拭子从病人的鼻咽部取样或者使用鼻腔灌洗液，将鼻咽拭子放入储存管中（含有生理盐水）。

2、样本准备步骤：
①将样本充分震荡混匀约10-15秒。

②在400-600xg转速下离心5-10分钟。

③弃上清。

④在沉淀中加2-3 mL PBS缓冲液（不能使用试剂盒中的浓缩洗液），充分震荡混匀约10-15秒。

⑤在400-600xg转速下离心5-10分钟。

⑥吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀。

⑦重复步骤4到6，直至黏液层被完全去除。

⑧在沉淀中加0.5-1 mL的PBS缓冲液。

⑨用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。

3、直接样本测试步骤：
①在8孔板上的孔内滴加25 µL的细胞悬浊液，每样本需滴加七孔。

②样本完全风干。

③在20ºC到25ºC，用预冷的100%丙酮固定细胞约5-10分钟。

④从丙酮中取出载玻片并风干。

⑤在固定并风干的细胞上，每一孔分别滴加不同的DFA鉴定染色试剂，试剂要完全覆盖细胞。

⑥可选步骤：在呼吸道病毒抗原对照板的每孔内滴加相对应的鉴定试剂。

抗原对照板包含了被病毒感染的细胞和未感染的细胞（板上标有NEG的孔为阴性对照孔，但滴加的是DFA染色试剂（任选一种），检验试剂是否有假阳性）。

⑦将载玻片放于35ºC到37ºC的恒温箱内孵育15到30分钟，为保持其湿润最好放置于带盖的盒子内。

⑧用事先稀释好的洗液（试剂盒中40X浓缩洗液）漂洗染色细胞。

为了更有效地洗涤，请将玻片在洗液中反复浸蘸4次左右。

⑨使用新的稀释洗液再洗一次。

⑩用去离子水再洗一遍。

4、观察实验结果
滴加2到3滴固定液，并加盖盖玻片，要注意避免产生气泡。

在200倍放大荧光显微镜下观察结果。

【结果判断】
200倍显微镜下每视野找到≥2个绿色荧光细胞即为阳性，否则为阴性。

阴性细胞被Evans Blue染成红色。

【检验结果的解释】
建议在检测样本前，首先对对照进行检测，以保证测试的可靠性，当观察到被感染的细胞中的明亮的苹果绿荧光时为阳性反应。

未感染的阴性细胞则被荧光试剂中所包含的伊文斯蓝染为暗红色。

实验人员应注意不要将成团细胞吸附抗体而产生的荧光与病毒特异性的荧光染色相混淆。

在少数情况下，因为中毒或不恰当的储存而导致的死细胞会非特异性的吸附抗体，呈现为灰暗和模糊的绿色荧光，充分洗涤可以帮助消除此类非特异性染色。

对于每种病毒，典型的苹果绿荧光染色样式如下：
流感病毒A型和B型：荧光染色为胞浆型，胞核型或两者皆有。

胞浆型染色通常为带大块细胞包涵物的颗粒状荧光。

而胞核型染色为均一的明亮荧光。

RSV：胞浆型荧光，为颗粒状并在合胞处有小块的细胞包涵物。

腺病毒：颗粒状的胞浆型荧光，明亮的胞核型荧光，或者两者皆有。

副流感病毒1、2、3型：胞浆型荧光，为颗粒状并有不规则的包涵物。

2型和3型可引起合胞体的形成。

在很多研究中均报道在单份样本中发现超过一种以上的病毒的同时感染。

如果在8孔玻片上多个孔中均发现有荧光细胞则表明有多重病毒同时存在。

根据与针对单种病毒的荧光试剂反应后是否有荧光染色来确定样本中存在的病毒。

在此类情况下，结果应报道为“直接样本检测发现某某病毒和某某病毒”或“细胞培养分离出某某病毒和某某病毒”。

A. 直接样本检测结果
样本的质量取决于其中所含上皮细胞的数量，通过在放大倍数200倍下对不同视野进行观察来评价样本的质量。

合格的样本要求在每个视野下至少有两个上皮细胞。

阴性结果为在至少含有20个柱状上皮细胞的样本中无荧光染色。

如果样本中上皮细胞数量少于20个则为样本不合格，此类样本的检测结果被视为无效，应重新采样再进行检测，或者将剩余的样本进行细胞培养后再检测。

如对合格的样本检测后未发现荧光染色的细胞，结果应被报告为“可能为阴性，在直接样本检测中未发现流感病毒A型，流感病毒B型，副流感病毒1、2、3型，腺病毒和呼吸道合胞病毒”。

但是这些阴性结果应通过细胞培养加以确认。

检测为阴性的样本，如果细胞培养后检测为阳性结果，则应被报告为“细胞培养后分理出某病毒”，此处的某病毒为所检测出的流感病毒A型，流感病毒B型，副流感病毒1、2、3型，腺病毒和呼吸道合胞病毒。

（见【检测结果的解释】B部分）
如果样本中发现被荧光染色的细胞，则表明该试剂所对应的病毒为阳性。

结果应被报告为“直接样本检测某病毒阳性”，此处的某病毒为所检测出的流感病毒A型，流感病毒B型，副流感病毒1、2、3型，腺病毒和呼吸道合胞病毒。

B.细胞培养分离/确认试验的检测结果
需对整个细胞点或单层细胞进行检查以确定是否有荧光染色的阳性细胞。

如果未发现被荧光染色的细
胞，样本检测的结果应被报告为“细胞培养分离未发现流感病毒A型，流感病毒B型，副流感病毒1、2、3型，腺病毒和呼吸道合胞病毒”。

如果发现被荧光染色的细胞，则表明该试剂所针对的病毒为阳性。

结果应被报告为“细胞培养分离发现某病毒阳性”，此处的某病毒为所检测出的流感病毒A型，流感病毒B型，副流感病毒1、2、3型，腺病毒和呼吸道合胞病毒。

【检测方法的局限性】
1、样本采集，保存及运输不当可能会导致假阴性结果。

2、本产品未建立对除呼吸道样本以外的样本进行直接检测的分析性能指标。

如使用者对除呼吸道样本以外种类的样本进行检测，应自行建立相关分析性能指标。

3、采用不同于本操作说明中所明示的温度与反应时间，可能会导致错误的检测结果。

4、样本的质量或对样本的处理对病毒检测有比较大的影响。

阴性检测结果并不排除病毒感染的可能。

需结合流行病学研究，临床症状以及其他诊断方法对本产品的检测结果进行解释。

5、对于抗病毒治疗对本产品的检测性能的影响，未建立相关信息。

6、本试剂盒中所使用的单克隆抗体来源于以病毒感染细胞为免疫原建立的杂交瘤。

对于特定病毒抗原能否被这些单克隆抗体所检测是未决的。

7、由于单克隆抗体是通过所限定的病毒株制备的，它们可能无法检测出所有病毒的变异型或新出现的病毒株。

单克隆抗体可能无法检测出在靶区域有微小氨基酸变异的病毒株。

8、本试剂盒中所使用的单克隆抗体不是亚型特异性的，因此不能对腺病毒或RSV的不同亚型进行分型检测。

9、在直接样本中检测出的一些病毒抗原可能来源于死病毒，因此不能进行细胞培养分离。

此类情况常见于RSV，因为RSV不稳定并且容易失活。

10、直接样本检测结果为阴性的样本应接种于适当的细胞进行病毒分离培养，以确定该样本中是否存在某种呼吸道病毒。

11、直接样本检测或细胞培养检测结果为阴性，并不能排除病毒感染存在的可能。

12、只有使用DHI公司提供的试剂组分，才能保证本试剂盒的检测性能。

13、将试剂盒过长时间保存于强光下会降低荧光强度。

如样本被含有大量蛋白A的金黄色葡萄球菌菌种污染，可能会导致明亮的荧光染色背景。

蛋白A会非特异性的与标记抗体Fc段结合，但可以通过形态学特征将此类结合与病毒抗原的结合区别开。

例如，金黄色葡萄球菌结合后的荧光通常为小亮点（直径为1 m）。

因此，对被细菌污染的细胞培养物的检测结果进行解释需谨慎。

【产品性能指标】
检验的灵敏度：荧光标记的单克隆抗体平均能检测出病毒的最低浓度约为1.0 PFU。

检验的特异性：用筛查和鉴定试剂对多种细胞和微生物进行交叉反应测试，对64种病毒、18种细胞、19种细菌均没有交叉反应。

【注意事项】
1.40X 浓缩洗液在2ºC-8ºC储存过程中可能会有盐的结晶析出，需放置室温溶解后再稀释。

2.在处理样本时，应尽可能在二级生物安全柜内操作。

3.样本准备步骤中，在清洗样本时请使用普通PBS，不要使用试剂盒内配套的浓缩洗液。

4.样本准备步骤中，一定要将黏液去除干净，否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。

5.丙酮是易挥发、可燃性物质，使用时请远离明火。

6.DFA染色试剂及40X 浓缩洗液中含有0.1%和4%的叠氮化钠。

此试剂有毒，操作时请带手套。

如试剂不
慎接触皮肤或眼睛，请用大量清水冲洗。

7.抗原对照板只能一次性使用。

8.在使用和储存DFA染色试剂时要避免接触明亮的光线。

9.请在保质期内使用。

【医疗器械注册证书编号】国食药监械(进)字2010第3401647号
附录：中英文对照表
英文名称缩写中文名称
Influenza A IA A型（甲型）流感病毒Influenza B IB B型（乙型）流感病毒Adenovirus AD 腺病毒
Respiratory Syncytial Virus RSV 呼吸道合胞病毒Parainfluenza 1 P1 副流感病毒1型Parainfluenza 2 P2 副流感病毒2型Parainfluenza 3 P3 副流感病毒3型英文名称中文名称
40X Wash Solution Concentrate
40X浓缩洗液Mounting Fluid 固定液Respiratory Virus
Antigen Control Slides
阳性质控板。