真菌蛋白提取方法

真菌蛋白提取方法

一TCA/丙酮法

1 液氮将菌体研磨为粉末；

2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮（含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇），过夜沉降；

3 4 度20,000g 离心15 min；

4 移处上清，用冰冷的含0.07% (v/v) β－巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次；

5 离心后，沉淀干燥至丙酮挥发完全。

二酚抽提法

1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末

2 加入 6 ml 水饱和酚（buffer-saturated phenol）和 2 ml提取液（20mM

Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,

0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

3 在4度混合30分钟。

4 12000 rmp 离心1min，使两相分开。

5 弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。

6 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。

7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。

三提取液抽提丙酮沉淀法

1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液（20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100

(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

4 混匀后4度震荡30分钟，以便蛋白溶解。

5 12000 rmp，4度，离心15分钟，吸取上清于另一EP管中。

7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮（含有0.07％β－巯基乙醇），混匀，

－20℃，2小时沉淀蛋白质。

8 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白。弃去上清，沉淀用乙醇洗三次，

自然干燥蛋白沉淀。

四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation

1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入4ml的抽提液（20mM Tris-Cl, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M

EDTA, pH 8.0, 0.07% β－巯基乙醇,protease inhibitors）。

4 12000 rmp，4度，离心10分钟，吸取上清于另一离心管中，尽量少吸上层

色素。

5 重复第4步。

6 加入16ml的预冷甲醇，涡旋，4度静置5分钟，

7 加入8ml预冷氯仿，涡旋，4度静置5分钟，

8 为使相分层，加入12ml水，剧烈混合，4度静置30分钟，8600g离心1min

9 移除上层水相

10 向下层氯仿相和中间蛋白沉淀加入12ml预冷甲醇，充分混合后，转入2.0 ml 离心管中，9000g离心5min沉淀蛋白。

11去上清，再加入1ml 甲醇：氯仿=3：2溶剂清洗蛋白一次，干燥蛋白沉淀，保存至使用。