真菌蛋白提取方法

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菌dna提取方法

菌dna提取方法

菌dna提取方法
菌DNA提取方法主要有以下几种常用的方法:
1. 热裂解法:将菌株经过培养后,取一部分菌体加入到含有蛋白酶K和SDS等裂解液的管内,经过高温加热和高速离心等步骤,将细胞裂解,使DNA释放到溶液中。

2. 真菌细胞壁裂解法:对于真菌等含有较坚硬的细胞壁的菌株,可以先用混合酶或纤维素酶等酶解细胞壁,然后再用热裂解法或理化方法提取DNA。

3. CTAB方法:CTAB(盐基洗脱法)常用于提取高质量的食管菌和黄杆菌等高GC含量的菌株DNA。

首先,将菌体经过裂解后,使用CTAB裂解液中的盐离子与DNA结合形成沉淀,然后通过洗脱步骤将DNA纯化。

4. 醋酸盐方法:醋酸盐方法适用于提取低GC含量的菌株DNA。

将菌体经过裂解后,通过添加醋酸盐裂解液,使DNA与醋酸和盐结合成为可溶性复合物,后续通过酒精沉淀等步骤将DNA沉淀出来。

5. 商业化基因提取试剂盒:市面上还有许多商业化的基因提取试剂盒,这些试剂盒提供了一套完整的操作流程和试剂,能够方便快速地提取和纯化菌DNA。

不同的菌株和研究目的可能需要使用不同的提取方法,因此在选择提取方法时需
要根据具体情况进行选择。

人造肉的制备方法

人造肉的制备方法

人造肉的制备方法人造肉是指通过生物技术手段,将植物蛋白、真菌蛋白或动物细胞培养而成的肉类替代品,因其具有可比拟的口感和营养成分,备受市场青睐。

下面,我们将介绍几种常用的人造肉制备方法。

一、植物蛋白制备植物蛋白是目前人造肉中被广泛使用的原料之一,它的制备过程如下:1. 植物蛋白素提取:将大豆、豌豆等植物蛋白素原料加入水中,经浸泡、过滤、沉淀、干燥等步骤,提取出植物蛋白素。

2. 蛋白素加工:将植物蛋白素加入调味料、油脂等辅料中,通过混合、搅拌、挤压等加工工艺,形成肉类的口感和纹理。

植物蛋白制备的优点在于所使用的原料广泛、生产过程简单、成本较低;缺点在于口感和营养成分与真正的肉类差距较大。

二、真菌蛋白制备真菌蛋白是一种从菌类中提取的蛋白质,其制备过程如下:1. 培养真菌菌体:在适当的温度、湿度和营养环境下,将真菌培养成菌体。

2. 提取蛋白质:将菌体经过菌体打破、蛋白质分离等步骤,提取出真菌蛋白。

3. 蛋白质加工:将提取出的真菌蛋白加入调味料、油脂等辅料中,通过混合、搅拌、挤压等加工工艺,形成肉类的口感和纹理。

真菌蛋白制备的优点在于口感和营养成分与真正的肉类相似、成本较低、易于控制生产过程;缺点在于资源较为有限。

三、细胞培养肉制备细胞培养肉是指通过体外培养动物细胞,使其分化为肌肉细胞,最终制备出与真正肉类相似的产品,其制备过程如下:1. 细胞获取:从动物肌肉中获取一定数量的细胞,如肌肉皮层细胞等。

2. 细胞培养:在适宜的培养环境中,添加合适的激素、营养物质等,使细胞进行分化、增殖。

3. 三维培养:将分化好的细胞放在类似肌肉的三维结构中,如使用胶原蛋白、纤维蛋白等构建的支架。

4. 肉质生成:随着细胞的生长和分化,三维结构中的细胞越来越多地类似与肌肉细胞,最终形成肉质组织。

细胞培养肉制备的优点在于不需要大量的饲料、水资源,减少对环境的污染,成本也在不断降低;缺点在于技术难度大、生产周期长、工艺复杂。

四、总结随着人类越来越重视健康和环保,人造肉的应用也在快步发展。

诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性

诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性

收稿日期:2018-11-01㊀㊀修回日期:2018-12-03基金项目:农业高校产学合作项目(2018N5005).作者简介:张玮玮(1993-)ꎬ女.研究方向:天然产物农药.Email:weiweiz2010@qq.com.通信作者叶秀娟(1968-)ꎬ女ꎬ教授ꎬ博士.研究方向:天然产物活性物质.Email:xiujuanye2004@gmail.com.诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性张玮玮ꎬ袁素素ꎬ王财成ꎬ叶秀娟(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室ꎬ福建福州350002)摘要:通过柱层析技术从诸葛菜种子中分离抗真菌蛋白ꎬ并采用纸片扩散法㊁琼脂平板稀释法和凹玻片法对抗真菌蛋白的抑菌活性和稳定性进行研究.结果表明:从诸葛菜种子中分离出一种分子质量约为10ku的抗真菌蛋白ꎬ命名为Zpꎻ经QE质谱鉴定ꎬZp蛋白可能是诸葛菜种子中的一种防御素蛋白.Zp蛋白对11种植物病原真菌均具有较强抑制作用ꎬ其中对尖孢镰刀菌生长的半抑制浓度(IC50)为54.36μg mL-1ꎬ对其孢子萌发的IC50为15.97μg mL-1.Zp蛋白的抑菌活性在温度0~100ħ和pH1~14的范围内稳定ꎬ其对有机溶剂(15%甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚和丙酮)和金属阳离子(50~250mmol L-1Mg2+㊁K+㊁Mn2+和Ca2+)也具有较强的耐受力.关键词:诸葛菜ꎻ抗真菌蛋白ꎻ纯化ꎻ抑菌活性ꎻ稳定性中图分类号:S482.1文献标识码:A文章编号:1671 ̄5470(2019)03 ̄0296 ̄07DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2019.03.004ExtractionofantifungalproteinfromOrychophragmusviolaceusseedsanditsantifungalactivityZHANGWeiweiꎬYUANSusuꎬWANGCaichengꎬYEXiujuan(KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiologyꎬFujianAgricultureandForestryUniversityꎬFuzhouꎬFujian350002ꎬChina)Abstract:AnantifungalproteinwasisolatedfromOrychophragmusviolaceusseedsbycolumnchromatographyꎬanditsantifungalac ̄tivityandstabilitywereinvestigatedbypaperdiffusionꎬagarplatedilutionandconcavityslidemethods.TheproteinpurifiedwasnamedZpꎬitwas10kuandidentifiedasadefensinproteinbymassspectrometry.Zpproteinhadstronginhibitoryeffectson11plantpathogenicfungi.TheIC50valuesofZpproteinagainstthegrowthandsporegerminationofFusariumoxysporumwere54.36and15.97μg mL-1ꎬrespectively.Itsantifungalactivitywasstablebetween0and100ħandunderpH1-14.Italsoexhibitedhighre ̄sistancetoorganicsolvents(15%methanolꎬethanolꎬisopropanolꎬetherandacetone)andmetalions(50-250mmol L-1Mg2+ꎬK+ꎬMn2+andCa2+).Keywords:Orychophragmusviolaceusꎻantifungalproteinꎻpurificationꎻantifungalactivityꎻstability抗菌蛋白是植物在长期进化过程中产生的具有抗微生物活性的一类防御性蛋白[1]ꎬ是机体天然免疫系统的重要组成部分.由于抗菌蛋白具有抗菌谱广㊁不易产生耐药性㊁低毒性等特点ꎬ极有可能成为一类新型抗菌素或植物源杀菌剂[2].众多研究人员已经从多种植物中分离出抗菌蛋白ꎬ并对其结构㊁功能和作用机理等进行了研究.例如:Yeetal[3]从甘蓝(Brassicaoleracea)种子中分离出一种分子质量约为30ku的蛋白ꎬ其对落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)㊁白色念珠菌(Candidaalbicans)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)均具有抑制作用ꎬ且该蛋白可以抑制鼻咽癌细胞和肝癌细胞的增殖ꎻLinetal[4]从芥蓝(Brassicaalboglabra)中纯化出的抗真菌蛋白(5907u)能够有效抑制尖孢镰刀菌(Fusariumoxyspo ̄rum)㊁玉蜀黍长蠕孢(Helminthosporiummaydis)㊁落花生球腔菌和苹果黑腐皮壳菌(Valsamali)的生长ꎬ还可以抑制肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MCF7的增殖ꎻLinetal[5]还从芸薹(Brassicacampestris)中分离出抗真菌蛋白campesin(9.4ku)ꎬ该蛋白可以抑制尖孢镰刀菌和落花生球腔菌的生长ꎬ对HepG2和MCF癌细胞的增殖也有抑制作用.随着研究的深入ꎬ这些天然活性产物的应用将更加广泛.诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)系十字花科诸葛菜属ꎬ因农历二月前后开蓝紫色花ꎬ又称二月蓝㊁翠紫花[6].诸葛菜营养价值较高ꎬ其根㊁茎和叶均可食用[7].诸葛菜种子富含维生素B1㊁维生素B2㊁维生素C和胡福建农林大学学报(自然科学版)第48卷第3期JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition)2019年5月萝卜素以及铁㊁钙等矿质元素[8-11]ꎻ其含油量高达35.8%ꎬ其中ꎬ棕榈酸㊁油酸和亚油酸含量较高ꎬ而亚麻酸和芥酸含量低ꎬ是非常优质的油料资源[12-14].目前ꎬ学者们已从十字花科多种植物如大白菜[15]㊁高菜[16]等中分离出抗真菌蛋白ꎬ但是有关诸葛菜种子中的抗真菌蛋白还未见报道.因此ꎬ本研究以诸葛菜种子为试验材料ꎬ分离纯化其抗真菌蛋白ꎬ并测定该蛋白的抑菌活性和稳定性ꎬ为促进诸葛菜抗真菌蛋白的应用提供参考.1㊀材料与方法1.1㊀材料与仪器诸葛菜种子:购买于江苏省宿迁市四季青种业有限公司.15种供试植物病原真菌:尖孢镰刀菌㊁稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)㊁灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)㊁芭乐炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)㊁禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)㊁长柄链格孢菌(Alterna ̄rialongipes)㊁烟草炭疽病菌(Colletotrichummicotianae)㊁玉蜀黍长蠕孢㊁小白菜炭疽(Colletotrichumhiggin ̄sianum)㊁落花生球腔菌㊁突脐蠕孢菌(Exserohilumturcicum)㊁茄病镰刀菌(Fusariumsolani)㊁苹果黑腐皮壳菌㊁辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)㊁小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)均由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室提供.仪器:Centrifuge5860R高速冷冻离心机(Eppendorf公司)ꎬLGJ ̄18S冷冻干燥机(上海松源华兴科技发展有限公司)ꎬAKTApure快速蛋白纯化系统(瑞典GE公司)ꎬSPX ̄250智能恒温培养箱(宁波赛福实验仪器厂).1.2㊀抗真菌蛋白的分离㊁纯化取150g诸葛菜种子ꎬ加入20mmol L-1醋酸铵缓冲液(pH4.6)800mLꎬ经豆浆机粉碎后置于4ħ匀浆浸提12hꎬ离心(8000r min-1ꎬ30min)后取上清液备用.将上清液上样于SP ̄Sepharose阳离子交换层析柱(5.0cmˑ20cm)ꎬ依次用含0.2㊁0.5和1.0mol L-1NaCl的20mmol L-1醋酸铵缓冲液进行梯度洗脱ꎬ在280nm波长下检测洗出液的光密度.将各组分收集ꎬ以尖孢镰刀菌为指示菌检测各组分抑菌活性.将有活性的组分透析ꎬ冷冻干燥后进一步用MonoSTM5/50GL强阳离子交换柱分离ꎬ该柱预先用20mmol L-1醋酸铵缓冲液平衡ꎬ用0~1.0mol L-1NaCl梯度洗脱ꎬ收集各洗脱峰ꎬ以尖孢镰刀菌为指示菌检测各洗脱峰抑菌活性.将有活性的组分透析并冷冻干燥ꎬ用20mmol L-1醋酸铵缓冲液溶解后上样于SuperdexTMPeptide10/300GL凝胶层析柱ꎬ收集各洗脱峰ꎬ以尖孢镰刀菌为指示菌检测各洗脱峰抑菌活性ꎬ并收集活性组分ꎬ透析并冷冻干燥.1.3㊀蛋白分子质量测定Tricine ̄SDS ̄PAGE电泳方法参考文献[3]ꎬ分离胶浓度16.5%ꎬ夹层胶浓度10%ꎬ浓缩胶浓度4%.初始电压为30Vꎬ电泳1h后调至80Vꎬ再继续电泳2.5h.电泳结束后ꎬ用考马斯亮蓝R ̄250染色2hꎬ再用脱色液(10%甲醇和10%乙酸)进行脱色.1.4㊀蛋白质谱分析将电泳检测为单一条带的样品经胰蛋白酶酶解后ꎬ用LCMSMS(nanoLC ̄QE)进行质谱分析ꎬ通过MASCOT等质谱匹配软件分析LCMSMS数据ꎬ通过UniProtKB数据库检索㊁比对㊁鉴定分离得到的蛋白质.质谱分析由上海中科新生命生物科技有限公司完成.1.5㊀蛋白的抗真菌活性检测用纸片扩散法[17]进行测定.将待测的植物病原真菌接种于PDA培养基上ꎬ28ħ恒温培养ꎬ待菌落生长至圆面直径为3.0~3.5cm时ꎬ将灭菌的圆滤纸片放在距离菌丝边缘0.5cm处ꎬ各取15μL蛋白样品和对照(PBS缓冲液ꎬpH7.4)加在滤纸片上ꎬ28ħ恒温培养至菌落生长到滤纸片边缘时ꎬ观察有无抑菌活性.1.6㊀蛋白对尖孢镰刀菌生长半抑制浓度(IC50)的测定采用琼脂平板稀释法[17]进行测定.将蛋白样品用PBS缓冲液配制成一系列浓度ꎬ并经0.22μm滤头过滤除菌.加热融化0.7%PDA培养基ꎬ待冷却至40~50ħ时ꎬ取0.5mL蛋白溶液(对照组为0.5mLPBS缓冲液)与1.5mL培养基于培养皿(30mmˑ15mm)中混匀ꎬ用打孔器截取相同大小真菌菌块ꎬ置于培养皿中心ꎬ封口 792 ㊀第3期张玮玮等:诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性并转移至28ħ恒温培养ꎬ直至对照组菌落生长至培养皿边缘.用十字交叉法测量真菌菌落的生长直径ꎬ并计算该蛋白对尖孢镰刀菌生长的抑菌率ꎬ每组3个重复.运用SPSS软件对数据进行Probit回归分析ꎬ计算IC50.菌丝生长抑制率/%=对照组菌落生长面积-处理组菌落生长面积对照组菌落生长面积ˑ1001.7㊀蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发IC50的测定1.7.1㊀孢子制备㊀将尖孢镰刀菌接种于PDA培养基上ꎬ28ħ黑暗条件下恒温培养7~15dꎬ取5mL无菌水加入上述培养皿中ꎬ用涂布器在真菌表面来回刮动ꎬ滤除菌丝得到孢子悬液.稀释孢子悬液至浓度为1ˑ106~1ˑ107CFU mL-1ꎬ取等体积孢子悬液与0.05%葡萄糖溶液混合备用.1.7.2㊀孢子萌发抑制率的测定㊀用凹玻片法[18-19]进行测定.将蛋白样品用PBS缓冲液配制成一系列浓度ꎬ并经0.22μm滤头过滤除菌.取10μL孢子悬浮液(对照组为PBS缓冲液)与10μL蛋白溶液混匀ꎬ加在凹玻片中央ꎬ置于含有两层浸湿的无菌滤纸片的培养皿(90mmˑ15mm)中ꎬ28ħ恒温保湿培养至对照组孢子萌发率达到90%以上时ꎬ将各培养皿放入4ħ冰箱中.6h后用光学显微镜观察并记录孢子萌发数ꎬ每组至少观察100个孢子ꎬ每组3个重复ꎬ计算孢子萌发抑制率.运用SPSS软件对数据进行Probit回归分析ꎬ计算IC50.孢子萌发率/%=孢子萌发数观察孢子数ˑ100孢子萌发抑制率/%=对照组孢子萌发率-处理组孢子萌发率对照组孢子萌发率ˑ1001.8㊀蛋白的稳定性检测1.8.1㊀热稳定性㊀取5个1.5mL离心管ꎬ分别加入抗真菌蛋白(用PBS缓冲液溶解ꎬpH7.4)0.1mLꎬ其中4管分别在40㊁60㊁80㊁100ħ条件下水浴15min(待冷却至室温时进行试验)ꎬ1管未处理作为阳性对照ꎬ另取1个离心管加入PBS缓冲液0.1mL作为阴性对照.以尖孢镰刀菌作为指示菌ꎬ采用纸片扩散法进行抑菌试验ꎬ每组设3个重复.1.8.2㊀pH稳定性㊀取7个1.5mL离心管ꎬ分别加入抗真菌蛋白(用PBS缓冲液溶解ꎬpH7.4)0.1mLꎬ其中6管分别加入调配好的pH值为1㊁3㊁5㊁10㊁12㊁14的PBS缓冲液0.1mLꎬ1管未处理作为阳性对照ꎬ另取1个离心管加入PBS缓冲液0.1mL作为阴性对照ꎬ室温放置1h.抑菌试验方法同1.8.1.1.8.3㊀有机溶剂稳定性㊀取6个1.5mL离心管ꎬ分别加入抗真菌蛋白(用PBS缓冲液溶解ꎬpH7.4)0.1mLꎬ其中5管分别加入用PBS缓冲液配制的15%(v/v)甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚㊁丙酮溶液0.1mLꎬ1管未处理作为阳性对照ꎬ另取5个离心管分别加入15%甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚㊁丙酮0.1mL作为阴性对照ꎬ室温放置1h.抑菌试验方法同1.8.1.1.8.4㊀金属离子稳定性㊀用PBS缓冲液分别配制50㊁100㊁150㊁200㊁250mmol L-1的Mg2+㊁K+㊁Mn2+㊁Ca2+溶液.取6个1.5mL离心管ꎬ分别加入抗真菌蛋白(用PBS缓冲液溶解ꎬpH7.4)0.1mLꎬ其中5管分别加入50㊁100㊁150㊁200㊁250mmol L-1Mg2+溶液0.1mLꎬ1管未处理作为阳性对照ꎬ以250mmol L-1Mg2+溶液作为阴性对照ꎬ室温放置1h.K+㊁Mn2+㊁Ca2+溶液按照同样的方法进行处理.抑菌试验方法同1.8.1.1.9㊀数据处理用Excel和SPSS17.0软件对数据进行分析处理.2㊀结果与分析2.1㊀抗真菌蛋白的分离、纯化诸葛菜种子蛋白上清液经SP ̄Sepharose阳离子交换柱分离后ꎬ得到4个洗脱组分a㊁b㊁c㊁d(图1A)ꎻ以尖孢镰刀菌为指示菌ꎬ用滤纸片法测得b组分具有抗真菌活性(图1B)ꎬ所以将b组分进一步纯化.b组分经MonoSTM5/50GL强阳离子交换柱分离后ꎬ得到5个洗脱峰e㊁f㊁g㊁h㊁i(图1C)ꎻ抑菌活性检测结果显示g洗脱峰具有抗真菌活性(图1D)ꎬ所以选择g组分进一步纯化.将g组分上样于SuperdexTMPeptide10/300GL凝胶层析柱进一步分离ꎬ得到j㊁k㊁l㊁m共4个洗脱峰(图1E)ꎻ抑菌活性检测结果表明l洗脱峰具有抗 892 福建农林大学学报(自然科学版)第48卷㊀真菌活性(图1F).A.SP ̄Sepharose柱层析ꎻB.SP ̄Sepharose柱层析各组分活性检测ꎻC.MonoSTM5/50GL柱层析ꎻD.MonoSTM5/50GL柱层析各组分活性检测ꎻE.SuperdexTMPeptide10/300GL柱层析ꎻF.SuperdexTMPeptide10/300GL柱层析各组分活性检测.a-m代表各洗脱组分ꎻCK.无菌水.图1㊀诸葛菜种子抗真菌蛋白的分离层析及各组分活性检测结果Fig.1㊀ColumnchromatographyandactivitydetectionoftheantifungalproteinfromO.violaceusseedsM.标准蛋白ꎻZ.Zp蛋白.图2㊀诸葛菜种子抗真菌蛋白的Tricine ̄SDS ̄PAGE电泳结果Fig.2㊀Tricine ̄SDS ̄PAGEelectrophoresisoftheantifungalproteinfromO.violaceusseeds㊀㊀Tricine ̄SDS ̄PAGE电泳结果(图2)表明ꎬ诸葛菜种子抗真菌蛋白经过3步分离纯化后ꎬⅠ组分蛋白呈单一条带ꎬ说明已达到较高纯度ꎬ其相对分子质量约为10kuꎬ将该蛋白命名为Zp.2.2㊀质谱分析结果将Tricine ̄SDS ̄PAGE电泳得到的单一条带进行质谱分析ꎬ在UniProtKB数据库中检索ꎬ结果如表1所示.经蛋白相似度和序列比对发现ꎬZp蛋白可能是诸葛菜种子中的一种防御素蛋白(defensin)ꎬ在UniProtKB数据库中的序列号为C9WGT1ꎬ相对分子质量为8737.17uꎬ这与电泳得出的Zp蛋白分子质量较为接近.表1㊀Zp蛋白的质谱鉴定与UniProtKB数据库检索结果Table1㊀Massspectrometryanddatabaseretrieva(UniProtKB)ofZpprotein蛋白蛋白名称序列号(UniProtKB数据库)序列分子质量/u1DefensinC9WGT1K.NQCINLEK.A8737.17DefensinC9WGT1K.NQCINLEK.A8737.17DefensinC9WGT1K.NQCINLEK.A8737.17DefensinC9WGT1K.NQCINLEK.A8737.17DefensinC9WGT1K.NQCINLEK.A8737.17DefensinC9WGT1R.HGSCNYVFPAHK.C8737.17DefensinC9WGT1R.HGSCNYVFPAHK.C8737.172ActinA0A0B5J8B2K.AGFAGDDAPR.A41705.3ActinA0A0B5J8B2R.LDLAGR.D41705.33ProteinYcf2A0A1S5SJW6R.EIQQLK.E270005.082.3㊀Zp蛋白的抗真菌活性Zp蛋白的抗真菌效果如图3所示ꎬ其对稻瘟病菌㊁灰葡萄孢菌㊁突脐蠕孢菌㊁烟草炭疽病菌㊁苹果黑腐皮壳菌㊁芭乐炭疽病菌㊁小白菜炭疽㊁玉蜀黍长蠕孢㊁落花生球腔菌㊁小孢拟盘多毛孢和尖孢镰刀菌共11种植物病原真菌均具有抑制作用ꎬ而对茄病镰刀菌㊁辣椒疫霉㊁长柄链格孢菌和禾谷镰刀菌等4种真菌没有明显的抑制作用.由此可知ꎬ诸葛菜种子抗真菌蛋白具有一定的广谱性. 992 ㊀第3期张玮玮等:诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性A.稻瘟病菌ꎻB.茄病镰刀菌ꎻC.灰葡萄孢菌ꎻD.突脐蠕孢菌ꎻE.烟草炭疽病菌ꎻF.苹果黑腐皮壳菌ꎻG.芭乐炭疽病菌ꎻH.小白菜炭疽ꎻI.玉蜀黍长蠕孢ꎻJ.辣椒疫霉ꎻK.落花生球腔菌ꎻL.长柄链格孢菌ꎻM.禾谷镰刀菌ꎻN.小孢拟盘多毛孢ꎻO.尖孢镰刀菌.CK.PBS缓冲液ꎻZ.Zp蛋白.图3㊀Zp蛋白的抗真菌效果Fig.3㊀AntifungaleffectsoftheZpproteinfromO.violaceusseeds2.4㊀Zp蛋白对尖孢镰刀菌生长的IC50Zp蛋白对尖孢镰刀菌生长的抑制效果如图4A所示.随着Zp蛋白浓度的增大ꎬ对尖孢镰刀菌生长的抑制率逐渐升高ꎬ当Zp蛋白浓度为142.5μg mL-1时ꎬ对尖孢镰刀菌的抑制率超过60%(图4B).Zp蛋白对尖孢镰刀菌生长抑制的Probit回归方程:Probit(p)=-1.530+0.882x.由此得出Zp蛋白对尖孢镰刀菌生长的IC50为54.36μg mL-1.A图中1㊁2㊁3㊁4㊁5㊁CK分别代表ZP蛋白浓度为285.0㊁142.5㊁71.3㊁35.6㊁17.8㊁0μg mL-1.图4㊀Zp蛋白对尖孢镰刀菌生长的抑制效果Fig.4㊀InhibtoryeffectsofZpproteinonthegrowthofF.oxysporum2.5㊀Zp蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发的IC50Zp蛋白可以抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发:与对照组相比ꎬ处理组孢子萌发数显著减少ꎬ且萌发的牙管较短ꎬ有的孢子形态膨大加粗ꎬ甚至出现畸形(图5A).随着Zp蛋白浓度增大ꎬ对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制率逐渐升高ꎬ当蛋白浓度为18.85μg mL-1时ꎬ孢子萌发抑制率达到60%(图5B).Zp蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发抑制的Probit回归方程:Probit(p)=-1.449+1.204x.由此得出Zp蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发的IC50为15.97μg mL-1.2.6㊀Zp蛋白的稳定性从图6A可看出ꎬZp蛋白在40㊁60㊁80㊁100ħ水浴处理15min后ꎬ对尖孢镰刀菌的抑制活性基本保持不变ꎬ表明该蛋白的热稳定性良好.由图6B可知ꎬZp蛋白在经不同pH值的溶液处理后ꎬ对尖孢镰刀菌仍 003 福建农林大学学报(自然科学版)第48卷㊀有较强的抑制作用ꎬ说明该蛋白的耐酸碱性较强.图5㊀Zp蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制效果Fig.5㊀InhibtoryeffectsofZpproteinonthegerminationofF.oxysporumsporesA.热稳定性ꎬ其中CK-为PBS缓冲液ꎬCK+为未处理的Zp蛋白ꎻB.pH稳定性ꎬ其中CK-为PBS缓冲液ꎬCK+为未处理的Zp蛋白ꎻC㊁D.有机溶剂稳定性ꎬ其中a1㊁a2㊁a3㊁a4㊁a5分别代表含有Zp蛋白的甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚㊁丙酮溶液ꎬb1㊁b2㊁b3㊁b4㊁b5分别代表不含Zp蛋白的相应溶液ꎬCK为未处理的Zp蛋白ꎻE㊁F㊁G㊁H分别为Ca2+㊁Mg2+㊁Mn2+㊁K+稳定性ꎬ其中a㊁b㊁c㊁d㊁e分别对应含Zp蛋白的50㊁100㊁150㊁200㊁250mmol L-1金属离子溶液ꎬCK-为不含Zp蛋白的250mmol L-1金属离子溶液ꎬCK+为未处理的Zp蛋白.图6㊀Zp蛋白的稳定性Fig.6㊀StabilityofZpprotein由图6C㊁6D可知ꎬ经15%甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚㊁丙酮溶液处理过的Zp蛋白能够明显抑制尖孢镰刀菌的生长ꎬ而单独的相应有机溶剂对尖孢镰刀菌生长并没有抑制作用ꎬ由此说明该蛋白对有机溶剂具有一定的耐受性.由图6E㊁6F㊁6G㊁6H可知ꎬ不含Zp蛋白的250mmol L-1Ca2+㊁Mg2+㊁Mn2+㊁K+溶液对尖孢镰刀菌生长没有抑制作用ꎬ而含有该蛋白的不同浓度(50㊁100㊁150㊁200㊁250mmol L-1)金属离子溶液对尖孢镰刀菌生长具有明显的抑制作用ꎬ说明Zp蛋白在强阳离子溶液中活性稳定.3㊀讨论与结论本研究从诸葛菜种子中分离出一种分子质量约为10ku的抗真菌蛋白Zp.Zp蛋白对多种植物病原真菌均具有抑制作用ꎬ其中对尖孢镰刀菌生长的IC50为54.36μg mL-1ꎬ对其孢子萌发的IC50为15.97μg mL-1.抗真菌蛋白存在于十字花科的多种植物种子中ꎬ且这些蛋白对多种植物病原真菌具有抑制活性.例如:油菜(Brassicanapus)种子中分离出的抗真菌蛋白(9412u)对尖孢镰刀菌和落花生球腔菌的IC50分别为78.12和42.35μg mL-1[20]ꎻ甘蓝种子中纯化出分子质量为30ku的抗真菌蛋白ꎬ对落花生球腔菌的IC50为150μg mL-1[3]ꎻ芥蓝种子中纯化出分子质量为5907u的抗真菌蛋白ꎬ对尖孢镰刀菌㊁玉蜀黍长蠕孢㊁落花生球腔菌和苹果黑腐皮壳菌的IC50分别为25.40㊁12.40㊁14.18和0.89μg mL-1[4].由此可知ꎬZp蛋白的抗真菌活性较强.经质谱鉴定ꎬZp蛋白可能是诸葛菜种子中的一种防御素蛋白.Chanetal[21]已经从褐色芸豆(Phaseolusvulgaris)的种子中分离出一种防御素类蛋白ꎬ分子质量为5.4kuꎬ该蛋白也具有抗真菌活性.防御素类蛋白是植物抗菌蛋白中数目最多的一个种类且具有广谱的抗菌活性[22].通过对Zp蛋白的抑菌 103 ㊀第3期张玮玮等:诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性203 福建农林大学学报(自然科学版)第48卷㊀活性进行检测可知ꎬ其对尖孢镰刀菌等11种真菌都有较强的抑制活性ꎬ表明该蛋白具有抑菌广谱性.防御素类蛋白还具有典型的三维稳定结构[23].检测可知ꎬZp蛋白具有良好的耐热㊁耐酸碱性ꎻ已有研究发现ꎬ油菜种子抗菌蛋白和芥蓝种子抗菌蛋白也具有热稳定性和强酸强碱稳定性[4ꎬ24-25].Zp蛋白对有机溶剂和金属离子也具有一定的耐受能力ꎻTerrasetal[26]研究表明ꎬ萝卜(Raphanussativus)种子Rs ̄AFP1和Rs ̄AFP2抗菌蛋白在K+溶液(50mmol L-1)中具有抑菌活性ꎬ且抑菌活性稳定.油菜㊁芥蓝㊁萝卜以及诸葛菜都属十字花科植物ꎬ说明十字花科多种植物种子中分离出的抗真菌蛋白具有一定的共性.综上所述ꎬZp蛋白抑菌谱广ꎬ抑菌活性稳定ꎬ具有潜在的应用价值.但有关诸葛菜种子抗真菌蛋白抑制植物病原真菌生长的具体作用机理还有待研究.参考文献[1]朱立成ꎬ罗辉ꎬ曾铂ꎬ等.慈菇中抗真菌蛋白分离纯化初步研究[J].井冈山大学学报(自然科学版)ꎬ2013ꎬ34(4):33-36. 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真菌生物基本分子实验(疏水蛋白为例)

真菌生物基本分子实验(疏水蛋白为例)
真菌疏水蛋白特征是8个半胱氨酸(Cys)残基以二硫键链接成特殊的方式排列于氨基酸序列中。根据Cys残基间距和亲水疏水氨基酸的分布方式分为Ⅰ型疏水蛋白和Ⅱ型疏水蛋白,蛋白质序列中疏水性氨基酸残基占有很大比例。8个保守Cys之间形成4个二硫键,其中第二个和第三个、第六个和第七个Cys总是连在一起。结构通式为:
Ⅱ型疏水蛋白结构式为X17~67—C—X9~10—CC—X17~39—C—X16—C—X6~9—CC—X10—C—X3~7,仅由子囊菌产生,其组装体稳定性相对较差,ห้องสมุดไป่ตู้够溶解在60%
雲(動)興河
信奉自然 1 追求平衡
真菌生物学基本分子实验(核酸和蛋白质提纯鉴定)
一、实验背景:
真菌疏水蛋白(fungal hydrophobin)是一类小分子分泌蛋白。它是真菌生命周期的基本因素,多数丝状真菌的顶端菌丝可分泌该蛋白,是细胞的一种延伸结构。这类蛋白在真菌黏附基质表面及气生菌丝的生长发育过程中发挥着极其重要的作用。
X2~139—C—X5~10—CC—X11~14—C—X8~23—C—X5~6—CC—X6~18—C—X2~13 C代表半胱氨酸,X代表除半胱氨酸的其它所有氨基酸。第一个半胱氨酸前氨基酸序列差异较大,而且很多疏水蛋白存在糖基化。一般情况下Ⅰ型疏水蛋白在Cys3和Cys4之间所形成的环状结构长度大于Ⅱ型疏水蛋白,而且在其N端第
目前研究得最广泛的是Ⅰ型疏水蛋白SC3,该蛋白是菌体形成气生菌丝所必需的结构,当SC3接触到空气和水或水和疏水物质(矿物油)的界面时其单体启动自组装过程,自发形成一种类似两性分子膜结构的聚合体,而且十分稳定,只有通过TFA抽屉才能将其破坏。SC3聚合体这种两性分子性质只有通过自组装才能完成,该过程包括SC3构象的变化。组装好的SC3疏水蛋白在一侧高度疏水,与水分子接触角度约为110°,其亲水一侧与水作用的角度约为36°,这在一定程度上是因为SC3糖基化使得甘露糖残基暴露于亲水侧。当膜形成于疏水性固体表面时其亲水面暴露,当膜形成于亲水性固体时其疏水面暴露,呈现了疏水蛋白自组装膜的两个极性相反的表面。也就是说当疏水蛋白的自组装介导菌丝附着于疏水物质表面时形成亲水层,当其遇到疏水物质表面后会发生自组装形成疏水层。疏水蛋白都是通过在极性相反的液-液界面自组装成疏水和亲水两性蛋白膜的机制来降低界面张力和自由能。

ctab法名词解释

ctab法名词解释

CTAB 法是一种化学方法,全称为十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide)法。

它是一种常用的离心法,用于提取和纯化DNA,并可与蛋白质、核酸和其他细胞组分分离。

CTAB 法主要应用于植物组织或真菌样本中DNA 的提取。

该方法利用CTAB 作为提取缓冲液的成分之一,其作用是溶解和去除细胞膜、蛋白质和多种污染物,从而使DNA 得以纯化。

CTAB 法的基本步骤包括以下几个关键步骤:
1. 组织样本裂解:将待提取的组织样本加入含有CTAB 提取缓冲液的离心管中,并通过机械碾磨或超声波处理等方法破坏细胞膜结构,释放DNA。

2. 蛋白质沉淀:加入氯仿或酚/氯仿混合液将蛋白质沉淀下来。

这一步骤的目的是去除细胞的蛋白质和其他杂质。

3. DNA 沉淀:加入等体积的异丙醇或乙醇,使DNA 沉淀出来。

这一步骤利用DNA 在高盐浓度和无机离子的条件下难溶于水的特性。

4. 清洗和纯化:将沉淀的DNA 用乙醇洗涤,并去除残留的盐和其他杂质。

最后,用缓冲液重溶DNA,得到纯净的DNA 溶液。

CTAB 法相对简单且成本较低,在植物分子生物学、遗传学和系统学研究中得到广泛应用。

其提取的DNA 可用于遗传分析、PCR 扩增、基因测序等各种实验技术和研究领域。

细菌总蛋白的提取方法

细菌总蛋白的提取方法

细菌总蛋白和膜蛋白提取方法一、从新鲜样品中提取总蛋白(简易法)1、自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,调pH值至8.5-9.0备用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。

该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

2、将40ml 菌液在12000g,4℃下离心15分钟收集菌体,沉淀用PBS悬浮洗涤2遍,沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎,采用300w,10s超声/10s间隔,超声20min,反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片,上清可直接变性后PAGE电泳检测,或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点:Western blotting结果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后,加氯仿分层,2-8℃下10000g离心15min,上层水相用于RNA提取,体积约为总体积的60%。

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。

每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3min,2-8℃不超过2000g离心5min。

3、将上清移至新的EP管中,用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇,室温放置10min,2-8℃下12000g离心10min,弃上清。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。

每1ml Trizol加入2ml洗液,室温放置20min,2-8℃下7500g离心5min,弃上清,重复洗涤2次。

最后加入2ml无水乙醇,涡旋后室温放置20min,2-8℃下7500g离心5min,弃上清。

5、冷冻干燥5-10min,1%SDS溶液溶解,反复吹打,50℃温浴使其完全溶解,2-8℃下10000g 离心10min去除不溶物。

丝状真菌蛋白提取方法

丝状真菌蛋白提取方法

BB-3104 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3123 BB-3183 BB-3187
活性蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒 植物核蛋白提取试剂盒 细菌膜蛋白提取试剂盒 植物膜蛋白提取试剂盒 酵母蛋白提取盒(2D 电泳用) 线粒体蛋白提取盒(2D 电泳用)
BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3152 BB-3185 BB-3191
用蛋白提取液研磨。 5. 每 100mg 菌体中加入 500ul 蛋白提取液,混匀后,在 4℃条件下振荡 15-20 分
钟。 6. 在 4℃,14000rpm 条件下离心 15 分钟。 7. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到真菌总蛋白。 8. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
丝状真菌蛋白提取试剂盒
产品组成:
产品组成 规格
丝状真菌蛋白提取液 蛋白酶抑制剂混合物
使用说明书
BB-3136-1 50 assays
25ml 100ul
1
BB-3136-2 100 assays
50ml 200ul
1
储存条件: 蛋白酶抑制剂-20℃保存;蛋白提取液室温保存。
有效期: 一年。
产品简介: 贝博丝状真菌蛋白提取试剂盒适用于从各种丝状真菌中提取总蛋白。优化的裂解液配
使用方法:
1. 提取液制备:每 500ul 丝状真菌蛋白提取液中加入 2 4℃,3000rpm 条件下离心 5-10 分钟,小心吸取培养基, 尽可能吸干,收集菌体。
3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 将菌体置于研钵中用液氮研磨 15 分钟左右至粉末。若无液氮研磨条件,可直接

真菌DNA提取的六种方法

真菌DNA提取的六种方法

真菌DNA提取方法方法一:取出约0.1 g 菌丝体,加入1 mL 裂解缓冲液( Tris-HCl 100 mmol/L (p H 9.0) ; EDTA 100 mmol/ L ;NaCl 400 mmol/L ;2 %SDS) ,加入少许石英砂,在研钵中将菌丝进行充分研磨。

将菌体移入1.5 mL 的离心管中,于65℃水浴保温30 min ,每10 min 取出充分混匀1 次。

加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为24 ∶24 ∶1) ,轻轻混匀5min ,12 000 r/ min 离心10 min 。

吸取上清液,加入等体积氯仿,轻摇5 min ,12 000r/ min 离心10 min 。

收集上清液,加入0.75 倍体积的异丙醇沉淀DNA ,用70 %乙醇冲洗2~3 次后自然风干,加入500μL 1 ×TE 缓冲液溶解DNA 。

加入2 μL RNase( 10 mg/ mL ) , 37 ℃水浴保温30min 。

加入等体积苯酚∶氯仿(体积比为1 ∶1) ,轻摇5 min ,12 000 r/ min 离心10 min 。

取上清液加入等体积氯仿,轻摇5 min ,12 000 r/ min 离心10 min 。

吸取上清液,用2 倍体积的无水乙醇沉淀DNA , -20 ℃短暂放置后,12 000 r/ min 离心。

用70 %的乙醇洗涤沉淀DNA 2 次,自然风干后溶于适量0.1 ×TE缓冲液中,贮存于- 20 ℃备用。

方法二1.实验试剂(1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS(2)3M NaAc(3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA(4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)(5)氯仿:异戊醇(24:1)(6)异丙醇(7)无水乙醇(8)75%乙醇(9)RNaseA2.实验步骤(1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉(2)加入4mL提取液,快速振荡混匀(3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本)(4)1000rpm,4℃,5min(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min)(6)取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min (7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃处理1h(9)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)(10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

真菌蛋白提取方法

真菌蛋白提取方法

真菌蛋白提取方法一TCA/丙酮法1 液氮将菌体研磨为粉末;2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮(含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇),过夜沉降;3 4 度20,000g 离心15 min;4 移处上清,用冰冷的含0.07% (v/v) β-巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次;5 离心后,沉淀干燥至丙酮挥发完全。

二酚抽提法1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末2 加入 6 ml 水饱和酚(buffer-saturated phenol)和 2 ml提取液(20mMTris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,0.07% β-巯基乙醇, protease inhibitors)。

3 在4度混合30分钟。

4 12000 rmp 离心1min,使两相分开。

5 弃沉淀,吸取上层的苯酚相,加入5倍体积的冷丙酮,-20度沉降2h。

6 12000 rmp,4度,离心15分钟沉淀蛋白,弃去上清。

7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。

三提取液抽提丙酮沉淀法1 预先将研钵置于-20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体,放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液(20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β-巯基乙醇, protease inhibitors)。

4 混匀后4度震荡30分钟,以便蛋白溶解。

5 12000 rmp,4度,离心15分钟,吸取上清于另一EP管中。

7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮(含有0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20℃,2小时沉淀蛋白质。

8 12000 rmp,4度,离心15分钟沉淀蛋白。

弃去上清,沉淀用乙醇洗三次,自然干燥蛋白沉淀。

四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation1 预先将研钵置于-20℃的冰箱内冷冻。

真菌dna提取步骤

真菌dna提取步骤

真菌dna提取步骤
真菌DNA提取是一项重要的实验技术,它可以用于研究真菌的遗传学特性,如基因组结构、功能基因的表达和调控等。

下面将介绍真菌DNA提取的步骤。

步骤一:样品准备
首先需要准备真菌样品,可以是培养物或者从自然环境中采集的真菌菌丝。

如果是培养物,需要在生长期内收集菌丝,如果是野生真菌,需要在采集后尽快处理样品。

步骤二:细胞破碎
将真菌样品放入离心管中,加入适量的研磨珠和研磨缓冲液,使用高速震荡器或者研磨器将样品破碎。

破碎后离心管中的混合物应该是均匀的悬浮液。

步骤三:细胞裂解
将破碎后的真菌悬浮液转移到离心管中,加入适量的裂解缓冲液和蛋白酶K,混合均匀后在60℃水浴中孵育30分钟。

这一步可以使真菌细胞壁和细胞膜破裂,释放DNA。

步骤四:DNA纯化
将裂解后的真菌悬浮液转移到离心管中,加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合液,混合均匀后离心分离。

上层的DNA溶液可以通过吸管转移到新的离心管中,加
入等体积的异丙醇混合液,混合均匀后离心分离。

上层的DNA沉淀可以用70%乙醇洗涤,最后用去离子水溶解DNA。

步骤五:DNA浓度和质量检测
使用分光光度计或者凝胶电泳等方法检测提取的DNA浓度和质量。

DNA的浓度应该在50-100 ng/μL之间,质量应该高,没有明显的降解或污染。

综上所述,真菌DNA提取的步骤包括样品准备、细胞破碎、细胞裂解、DNA 纯化和DNA浓度和质量检测。

这些步骤需要严格控制条件,以确保提取的DNA 质量高、纯度高、浓度适宜,从而保证后续实验的成功进行。

三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇

三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇

三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究1蛋白酶是一类具有水解蛋白质能力的酶,广泛存在于细胞中并参与多种生物学过程。

在生物制药等领域,蛋白酶的纯化、性质及应用研究具有重要的现实意义。

本文将重点介绍来自植物、细菌和真菌三种不同来源的蛋白酶在纯化、性质和应用方面的研究进展。

一、植物蛋白酶的纯化、性质和应用植物蛋白酶主要存在于种子、果实、根茎等植物组织中,其中的大多数是半胱氨酸蛋白酶。

植物蛋白酶的纯化主要采用柱层析法和电泳法等技术。

研究表明,植物蛋白酶的氨基酸序列存在着相似性和区别性,其中一些同源物可以分为家族或亚家族。

此外,植物蛋白酶的活性受到温度、pH值和抑制剂等因素的调节。

植物蛋白酶在食品加工和医药制品等方面可发挥重要作用。

例如,灵芝多肽可以被植物蛋白酶水解成具有生物活性的多肽物质,这对于灵芝多肽的生产具有重要意义。

另外,复合酶制剂SiOpro可以通过作用于面团中的酯酶、氧化酶和蛋白酶等多种酶的协同作用,达到改善松软度、延长保质期等目的。

二、细菌蛋白酶的纯化、性质和应用细菌蛋白酶主要可分为内质网蛋白酶和外源性蛋白酶两种。

前者在细胞内、后者在菌体周围均有分布。

细菌蛋白酶的纯化常常采用柱层析技术和亲和层析技术等,具有高效、快速、经济等优势。

细菌蛋白酶在医药、食品及皮革制品等方面应用广泛。

例如,基于外源性蛋白酶的制剂Accutase是用于脱离培养细胞的酶,具有无细胞毒性、操作简单等特点;生产蛋白药物方面,葡萄球菌的外源性蛋白酶已被用于制备重组蛋白;在食品加工过程中,外源性蛋白酶可以提高油脂的提取效率和品质。

三、真菌蛋白酶的纯化、性质和应用真菌蛋白酶可分为胶原酶和无胶原酶两大类。

前者主要用于胶原的加工,后者则广泛应用于食品加工、纸张制品、色谱等领域。

真菌蛋白酶的纯化方法有很多种,包括柱层析、电泳、反向相色谱法等。

真菌蛋白酶在pH值、温度、金属离子和阻碍剂等条件下均表现出不同的活性和特异性。

真菌蛋白提取方法

真菌蛋白提取方法

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产品 核蛋白提取试剂盒 Bradford 蛋白定量试剂盒 ECL 化学发光检测试剂盒 细胞蛋白提取试剂盒 组织蛋白提取试剂盒 酵母蛋白提取试剂盒 磷酸化蛋白提取试剂盒 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒
产品号 3102 3411 3501 3121 3122 3125 3105 3702
产品 膜蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒 蛋白 Marker 细菌膜蛋白提取试剂盒 植物总蛋白提取试剂盒 蛋白酶抑制剂混合物 蛋白磷酸酶抑制剂混合物 SDS-PAGE 上样 Buffer
盒组分针对厚细胞壁样本进行优化,提取过程简单方便,可在 1 小时内完成。该试剂盒含有 的蛋白酶抑制剂混合物,阻止了蛋白酶对蛋白的降解,为提取高纯度的蛋白提供了保证。提 取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。
使用方法: 1. 提取液制备:每 500ul 冷的真菌蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物, 4ul 蛋白稳定剂,混匀后置冰上备用。 2. 取 100mg 组织样本剪碎①,置于研钵中用液氮研磨。(没有液氮研磨条件也可直 接加入提取液后置冰上研磨即可) 3. 研磨后加入 500ul 真菌蛋白提取液。 4. 混匀后,在 4℃条件下振荡 20-30 分钟。 5. 在 4℃,14000rpm 条件下离心 10 分钟。 6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到真菌总蛋白。 7. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
真菌蛋白提取试剂盒
产品组成:
产品组成 规格
真菌蛋白提取液 蛋白稳定剂
蛋白酶抑制剂混合物
BB-31ul
BB-3127-2 100T 50ml 400ul 200ul

真菌胞内蛋白质提取方法的建立

真菌胞内蛋白质提取方法的建立

[文章编号] 1671-587Ⅹ(2012)03-0590-05[收稿日期] 2011-08-15[基金项目] 国家自然科学基金资助课题(30910103903,30770120)[作者简介] 王 爽(1976-),女,吉林省长春市人,主治医师,医学博士,主要从事真菌分子学鉴定及耐药机制的研究。

[通信作者] 王 丽(Tel:0431-85619486,E-mail:wli99@jlu.edu.cn)真菌胞内蛋白质提取方法的建立王 爽1,2,姜兰香1,张 宇2,3,贺 丹2,田 庄2,高 嵩2,横山耕治4,王 丽2(1.吉林大学第二医院皮肤科,吉林长春130041;2.吉林大学白求恩医学院病原生物学系,吉林长春130021;3.吉林大学第二医院检验科,吉林长春130041;4.日本千叶大学真菌研究中心,日本千叶260-8673)[摘 要] 目的:研究不同的提取方法对白假丝酵母和茄病镰刀菌胞内蛋白质浓度、种类及数量的影响,为建立一种稳定可靠的真菌胞内蛋白质提取方法提供依据。

方法:分别以白假丝酵母菌和茄病镰刀菌为研究对象,培养时间为36、48和72h,超声波工作时间为20s、3min、5min,10min,超声波功率为332.5和475.0W,通过蛋白质浓度检测和SDS-PAGE蛋白质电泳分析,比较不同条件下提取的蛋白质浓度、种类及数量,观察不同因素对蛋白质提取效果的影响。

结果:2株真菌均在培养36h时提取胞内蛋白质的浓度最大,白假丝酵母在功率332.5W、超声3min时得到胞内蛋白质的数量和种类最多,茄病镰刀菌在功率332.5W、超声10min时得到蛋白质的数量和种类最多。

结论:使用超声波法与玻璃珠研磨法结合提取胞内蛋白质,从菌株的培养时间、超声波工作时间和功率3方面建立了真菌胞内蛋白质的最佳提取方法。

[关键词] 白假丝酵母;茄病镰刀菌;超声波;培养时间[中图分类号] R379.2 [文献标志码] AEstablishment of intracellular protein extractionmethods from fungusWANG Shuang1,2,JING Lan-xiang1,ZHANG Yu2,3,HE Dan2,TIAN Zhuang2,GAO Song2,KOJI Yokoyama4,WANG Li 2(1.Department of Dermatology,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China;2.Department of Pathogen Biology,Norman Bethune College of Medicine,Jilin University,Changchun130021,China;3.Department of Laboratory,Second Hospital,Jilin University,Changchun130041,China;4.Medical Mycology Research Center,Chiber University,Chiba 260-8673,Japan)Abstract:Objective To study the effect of different cultivate time,ultrasonic time and ultrasonic power on theconcentration,type and quantity of the intracellular protein from Candida albicans and Fusarium solina and toprovide the theoretical basis for establishing a reliable and stable extraction method for intracellular protein fromfungus.Methods Candida albicans and Fusarium solina were cultured.The different parameters included theculture time(36,48,and 72h),ultrasonic time(20s,3min,5min,and 10min)and ultrasonic power(332.5Wand 475.0W).The concentrations,species and quantities of protein under different factors were detected by theprotein concentration detection and SDS-PAGE electrophoresis analysis.Results Both strains got the most quantityof protein when cultivated for 36h.The most quantity and species of Candida albicans were obtained when theultrasonic power was 332.5Wand ultrasonic time was 3min,but as to Fusarium solina,the correspondingparameters were 332.5Wand 10min,respectively.Conclusion The intracellular protein is extracted bycompositely using ultrasonic method and glass bead transformation method.The optimal extraction method of095第38卷 第3期2012年5月吉 林 大 学 学 报 (医 学 版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.38No.3 May 2012intracellular protein from fungus is developed from the aspects of culture time,ultrasonic power and ultrasonicworking time of strains.Key words:Candida albicans;Fusarium solani;ultrasound;culture time 随着免疫力低下或免疫缺陷患者等易感人群的不断增加,条件致病性真菌感染的发生率呈上升趋势,严重威胁患者的健康和生命[1-2],真菌致病和耐药机制的研究已成为当前研究的热点问题。

真菌蛋白的制造过程

真菌蛋白的制造过程

真菌蛋白的制造过程引言:真菌蛋白是一类由真菌合成的蛋白质,具有广泛的生物学功能和应用价值。

其制造过程涉及到菌种选择、发酵培养、蛋白表达、纯化和验证等多个环节。

本文将详细介绍真菌蛋白的制造过程,并探讨其在生物医药和农业领域的应用前景。

一、菌种选择在制造真菌蛋白之前,首先需要选择合适的菌种。

常用的真菌菌种包括酿酒酵母、大肠杆菌、大黄蜂菌等。

选择菌种时需要考虑其生长速度、表达效率、分泌能力以及对外界条件的适应性等因素。

同时,还需考虑目标蛋白所在的真菌菌种,以便在后续的表达和纯化过程中获得较高的产量和纯度。

二、发酵培养选择好菌种后,接下来是进行发酵培养。

发酵培养是真菌蛋白制造的关键步骤之一。

其目的是提供适宜的生长环境,促进菌株的繁殖和蛋白表达。

发酵培养液的组成要根据菌株的需求进行调整,包括碳源、氮源、矿物质和生长因子等。

同时,还需要控制培养液的温度、pH值、氧气和搅拌速度等因素,以优化真菌的生长和蛋白表达。

三、蛋白表达在发酵培养过程中,真菌会合成目标蛋白。

蛋白表达的机制主要包括转录和翻译两个过程。

转录是真菌将基因信息转录成RNA的过程,而翻译则是将RNA翻译成蛋白质。

在蛋白表达过程中,可以通过基因工程技术来优化目标蛋白的表达水平和纯度。

例如,可以通过引入外源基因、调节启动子和增加信号肽等方式来提高蛋白表达的效率。

四、纯化在真菌蛋白表达后,需要对其进行纯化。

纯化是将目标蛋白从其他杂质中分离出来的过程,旨在获得高纯度的蛋白样品。

常用的纯化方法包括离心、过滤、层析和电泳等。

离心和过滤可以用于去除大分子杂质,层析则可以根据蛋白的特性选择合适的分离介质,电泳则可用于分离蛋白的大小和电荷。

在纯化过程中,还需要进行监测和分析,以确保蛋白的纯度和活性。

五、验证对制造的真菌蛋白进行验证是必不可少的一步。

验证的目的是确认蛋白的纯度、活性和功能等。

常用的验证方法包括质谱分析、酶活性测定、免疫印迹和功能性实验等。

通过这些验证手段,可以评估蛋白的质量和性能,并为其后续应用提供可靠的依据。

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真菌蛋白提取方法
一TCA/丙酮法
1 液氮将菌体研磨为粉末;
2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮(含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇),过夜沉降;
3 4 度20,000g 离心15 min;
4 移处上清,用冰冷的含0.07% (v/v) β-巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次;
5 离心后,沉淀干燥至丙酮挥发完全。

二酚抽提法
1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末
2 加入 6 ml 水饱和酚(buffer-saturated phenol)和 2 ml提取液(20mM
Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,
0.07% β-巯基乙醇, protease inhibitors)。

3 在4度混合30分钟。

4 12000 rmp 离心1min,使两相分开。

5 弃沉淀,吸取上层的苯酚相,加入5倍体积的冷丙酮,-20度沉降2h。

6 12000 rmp,4度,离心15分钟沉淀蛋白,弃去上清。

7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。

三提取液抽提丙酮沉淀法
1 预先将研钵置于-20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体,放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液(20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100
(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β-巯基乙醇, protease inhibitors)。

4 混匀后4度震荡30分钟,以便蛋白溶解。

5 12000 rmp,4度,离心15分钟,吸取上清于另一EP管中。

7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮(含有0.07%β-巯基乙醇),混匀,
-20℃,2小时沉淀蛋白质。

8 12000 rmp,4度,离心15分钟沉淀蛋白。

弃去上清,沉淀用乙醇洗三次,
自然干燥蛋白沉淀。

四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation
1 预先将研钵置于-20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体,放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入4ml的抽提液(20mM Tris-Cl, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M
EDTA, pH 8.0, 0.07% β-巯基乙醇,protease inhibitors)。

4 12000 rmp,4度,离心10分钟,吸取上清于另一离心管中,尽量少吸上层
色素。

5 重复第4步。

6 加入16ml的预冷甲醇,涡旋,4度静置5分钟,
7 加入8ml预冷氯仿,涡旋,4度静置5分钟,
8 为使相分层,加入12ml水,剧烈混合,4度静置30分钟,8600g离心1min
9 移除上层水相
10 向下层氯仿相和中间蛋白沉淀加入12ml预冷甲醇,充分混合后,转入2.0 ml 离心管中,9000g离心5min沉淀蛋白。

11去上清,再加入1ml 甲醇:氯仿=3:2溶剂清洗蛋白一次,干燥蛋白沉淀,保存至使用。

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