一种阿片受体变构调节剂筛选模型及应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011297488.0
(22)申请日 2020.11.18
(71)申请人 泰州医药城国科化物生物医药科技
有限公司
地址 225300 江苏省泰州市药城大道一号
(创业路东侧、园南路北侧)新药创制
基地二期C幢大厦12-15层
(72)发明人 梁鑫淼　侯滔　王纪霞　赵耀鹏　
王志伟　陆金立　
(74)专利代理机构 南京禾祁专利代理事务所
(普通合伙) 32462
代理人 黄天天
(51)Int.Cl.
C12N 5/10(2006.01)
C12Q 1/02(2006.01)
(54)发明名称
一种阿片受体变构调节剂筛选模型及应用
(57)摘要
本发明涉及一种阿片受体变构调节剂筛选
模型及应用。

本发明利用高表达Delta阿片受体
的HEK293‑Delta稳转细胞株的特点，利用高通量
实时荧光检测分析系统（FLIPR）平台，构建筛选
Delta阿片受体调节剂的模型。

本发明所构建的
基于高通量实时荧光检测分析系统（FLIPR ）平台
的Delta阿片受体调节剂筛选模型具有新颖、高
灵敏度、可靠、操作简便、试验周期短及能高通量
筛选等特点，其用于从天然产物库、代谢产物库
及组合化学库中发现Delta阿片受体变构调节
剂，以及Delta阿片受体密切相关的中枢神经系
统疾病，如成瘾、疼痛、抑郁、帕金森病、学习和认
知等，和心脏病、缺血性中风、癌症等疾病的药物
筛选。

权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 112391351 A 2021.02.23
C N 112391351
A
1.一种Delta阿片受体变构调节剂筛选模型，其特征在于：利用高表达Delta阿片受体的HEK293-Delta稳转细胞株的特点，利用高通量实时荧光检测分析系统平台，构建筛选Delta阿片受体调节剂的模型。

2.根据权利要求1所述的一种Delta阿片受体变构调节剂筛选模型，其特征在于：在FLIPR平台专用的96微孔板中接种HEK293-Delta细胞，接种的细胞密度为6.0～8.0×104个/孔，细胞培养液体积为100μL/孔，接种后细胞培养时间为18～24h。

3.一种Delta阿片受体变构调节剂筛选模型的应用，其特征在于：在接种HEK293-Delta 细胞的FLIPR专用96孔细胞培养板中加入待测样品和脑啡肽，若脑啡肽的活性随着待测样品浓度的增加而提高，则表明待测样品可正向调节脑啡肽的活性，可判断待测样品为Delta 阿片受体的正向调节剂。

4.根据权利要求3所述一种Delta阿片受体变构调节剂筛选模型的应用，其特征在于：具体包括以下步骤：
[1] 将溶解在HBSS缓冲盐中的Delta受体激动剂脑啡肽的变构阳性分子BMS986187，固定浓度，浓度范围为0 μM ~ 10 μM加入到接种HEK293-Delta细胞的96孔细胞培养板中，检测其钙流信号；
[2] 再向步骤[1]中加入了Delta阿片受体变构阳性分子BMS986187的96孔细胞培养板中继续加入Delta受体激动剂脑啡肽，Delta受体激动剂脑啡肽的浓度为0.06 nM ~ 1000 nM，检测钙流信号；
[3] 步骤[2]获得的脑啡肽的活性具有随BMS986187的浓度提高而增加，脑啡肽的EC50值随着BMS986187的浓度的提高而减小，可判断待测样品是Delta阿片受体激动剂的正向调节剂。

5.根据权利要求3所述一种Delta阿片受体变构调节剂筛选模型的应用，其特征在于：Delta受体变构调节剂筛选模型用于对商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及化学修饰物的筛选，获得Delta受体变构调节剂。

权　利　要　求　书1/1页CN 112391351 A
一种阿片受体变构调节剂筛选模型及应用
技术领域
[0001]本发明涉及阿片受体变构调节剂的筛选模型及应用，具体地说是一种Delta 阿片受体变构调节剂筛选模型及应用。

背景技术
[0002]G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)是七次跨膜受体，其数量高达800个，是细胞信号传导中最重要的一类膜受体，在疾病的发生发展中发挥着重要的调控作用，因此是小分子药物开发中最受关注的药物靶点。

目前FDA批准的约34％的药物靶标为GPCRs。

Delta阿片受体是一种具有7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体，除了疼痛调节和成瘾，它还广泛参与各种生理以及病理活动，例如对学习、记忆以及内分泌、心血管、呼吸和免疫等系统的调节作用。

Delta阿片受体变构调节剂结合与天然配体结合位点之外，能够调节异源二聚体亚基或结构域间的相互作用，并具有较高的特异性和药物安全性，同时可以保持受体信号在时间和空间上的可控性。

因此变构调节剂在Delta受体靶点新药物开发方面起到了重要作用。

[0003]目前变构调节剂的筛选方法主要有传统的放射性配体受体结合实验法、 GTPγS 结合实验法、及β-arrestin的招募检测法等。

但这些方法都有一定的局限性，传统的放射性配体受体结合实验法需要洗涤和过滤，实验周期长及通量低等不足。

[0004]FLIPR Tetra是高通量CCD成像读板机，适合于生命科学研究和高通量药物筛选，例如在分子生物学、植物学、遗传学、动物学、微生物学、病理学与病理生理学等学科研究中，特别是在药物筛选中的GPCR的钙流检测中，可定量检测细胞内的钙流。

钙流检测是生物学中一个重要的检测指标，在国际上，用于 GPCR的钙流定量检测技术更是越来越被广泛应用的化合物筛选技术。

FLIPR还可用于更精确荧光定量定性检测，其采用的是CCD直接成像，更适合日益增多的GPCR细胞学研究。

因此，基于FLIPR平台建立Delta受体变构调节剂的筛选模型，具有检测结果可靠、灵敏度高、筛选通量高、周期短及操作简便等特点，其可以大大提高Delta阿片受体变构调节剂的发现效率，对阐述Delta变构调节剂的药理学和生理学功能具有重要意义，同时为Delta阿片受体密切相关的中枢神经系统疾病，如成瘾、疼痛、抑郁、帕金森病、学习和认知等，和心脏病、缺血性中风、癌症等疾病的药物筛选提供指导。

发明内容
[0005]本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，借助于高通量实时荧光检测分析系统(FLIPR)平台，提供一种Delta受体变构调节剂细胞筛选模型，以实现基于细胞内钙流信号变化的Delta受体变构调节剂的筛选。

[0006]为了实现上述目的，借助于高通量实时荧光检测分析系统(FLIPR)，提供一种Delta阿片受体变构调节剂细胞筛选模型，用于高通量筛选Delta阿片受体变构调节剂，以及Delta阿片受体密切相关的中枢神经系统疾病，如成瘾、疼痛、抑郁、帕金森病、学习和认知等，和心脏病、缺血性中风、癌症等疾病的药物筛选。

[0007]本发明的技术方案为：
[0008]基于高通量实时荧光检测分析系统(FLIPR)，利用稳定表达Delta阿片受体的细胞系HEK293-Delta，借助于已知的Delta阿片受体激动剂，建立Delta阿片受体变构调节剂的细胞筛选模型。

根据待测样品对Delta阿片受体激动剂活性的提高，判断待测样品对Delta 阿片受体激动剂的正向调节作用。

[0009]其中，所述的高通量实时荧光检测分析系统(FLIPR)检测的信号为荧光信号值(RFU)，通过高通量实时荧光检测分析系统(FLIPR)Calcium-6检测试剂盒实现。

[0010]其中，所述的Delta阿片受体变构调节剂细胞筛选模型在96微孔板中接种 HEK293-Delta细胞，接种的细胞密度为6.0～8.0×104个/孔，细胞培养液体积为 100μL/孔，接种后细胞培养时间为18～24h。

[0011]一种Delta阿片受体变构调节剂细胞筛选模型的应用，待测样品具有正向调剂活性的筛选步骤如下：
[0012](1)将待测样品加入到接种HEK293-Delta细胞的96微孔板中，待测样品各组浓度为10μM、2.5μM、0.625μM、0.156μM、0μM，检测其荧光信号值 (RFU)；
[0013](2)若步骤(1)中检测到无或弱荧光信号，则向步骤(1)中的HEK293-Delta 细胞的微孔板中各待测样品组加入Delta阿片受体激动剂脑啡肽，浓度为0.06～1000nM，检测其荧光信号值(RFU)；
[0014](3)若步骤(2)中的脑啡肽根据荧光信号值(RFU)所得到EC50值随着待测样品的浓度增加而减小，可判断待测样品是Delta阿片受体激动剂的正向调节剂。

[0015]其中，所述的Delta受体变构调节剂筛选模型用于对商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及化学修饰物的筛选，获得Delta受体变构调节剂。

[0016]本发明利用建立的Delta阿片受体变构调节剂细胞筛选模型可对商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及化学修饰物进行高通量筛选，获得Delta阿片受体的调节剂。

此外，根据靶点与疾病的相关性，发现 Delta阿片受体在中枢神经系统疾病，如成瘾、疼痛、抑郁、帕金森病、学习和认知等，和心脏病、缺血性中风、癌症等疾病中发挥重要作用，也可开展相关疾病的药物筛选。

附图说明
[0017]图1：不同浓度的BMS986187在HEK293-Delta细胞上的荧光信号值(RFU)；[0018]图2：不同浓度的BMS986187预处理HEK293-Delta细胞5min后，脑啡肽在 HEK293-Delta细胞上的荧光信号值(RFU)量效曲线。

具体实施方式
[0019]现结合实例，对本发明做进一步说明。

实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

[0020]实施例1：Delta阿片受体激动剂调节剂BMS986187在HEK293-Delta细胞上的荧光信号值
[0021]人胚肾细胞HEK293-Delta细胞来源于中国科学院大连化学物理研究所，倒置显微镜购于OLYMPUS。

脑啡肽(货号：1889)和BMS986187(货号：5983) 购于Tocris公司。

培养液
DMEM(货号：01-052-1ACS)购于Biological Industries 公司；胎牛血清(FBS，货号：10099141)购于Gibco公司；平衡盐溶液HBSS (货号：14065-056)和HEPES(货号：15630-080)购于Gibco公司。

Calcium-6 荧光染料试剂盒(货号：3221567)购于MolecularDevices公司，掩蔽染料Amaranth (货号：A1016-50G)购于Sigma公司；细胞培养板为高通量实时荧光检测分析系统(FLIPR)专用96微孔板(货号：655090)，购于Greiner公司。

检测平台高通量实时荧光检测系统，购于Molecular Devices公司。

[0022]将处于对数生长期的HEK293-Delta细胞，接种于细胞兼容高通量实时荧光检测分析系统(FLIPR)专用96微孔板中，所用培养基为DMEM(含10％FBS)，每孔的接种体积为100μL，接种密度为7.0×104个/孔，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养20～24h，至细胞融合度达95％左右，进行活性检测。

将培养好的细胞除去培养基并于每孔中加入100μL荧光染料溶液(Calcium-6)在37℃下恒温孵育1h；除去染料溶液并于每孔加入100μL Amaranth (0.5mg/mL)，室温孵育5min；将BMS986187加入到接种HEK293-Delta细胞的微孔板中， BMS986187各组浓度为10μM、2.5μM、0.625μM、0.156μM、0μM，每组16 个复孔，每孔加样50μL，在520nm和488nm波长下进行钙流荧光信号检测。

结果如图1所示，不同浓度BMS986187的钙流荧光信号值与对照组一致，说明 BMS986187不能引起钙流信号的变化。

[0023]实施例2：Delta阿片受体激动剂脑啡肽在HEK293-Delta细胞上的荧光信号值[0024]将处于对数生长期的HEK293-Delta细胞，接种于细胞兼容高通量实时荧光检测分析系统(FLIPR)专用96微孔板中，所用培养基为DMEM(含10％FBS)，每孔的接种体积为100μL，接种密度为7.0×104个/孔，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养20～24h，至细胞融合度达95％左右，进行活性检测。

将培养好的细胞除去培养基并于每孔中加入100μL荧光染料溶液(Calcium-6)在37℃下恒温孵育1h；除去染料溶液并于每孔加入100μL Amaranth (0.5mg/mL)，室温孵育5min；将BMS986187加入到接种HEK293-Delta细胞的微孔板中， BMS986187浓度为10μM、2.5μM、0.625μM、0.156μM、0μM置于药物板A 中，每个浓度16个复孔；将脑啡肽从1000nM起4倍稀释稀释，共8个浓度分别为1000nM、250nM、62.5nM、15.63nM、3.91nM、0.98nM、0.24nM、0.06 nM置于药物板B中，每个浓度2个复孔；采用FLIPR仪器进行药物板A和B 自动加样，每孔50μL，在520nm和488nm波长下进行钙流荧光信号(RFU) 检测。

检测结果如图2和表1所示，BMS986187能提高脑啡肽在Delta阿片受体上的活性，其活性随着BMS986187的浓度提高而增加，脑啡肽的EC50值随着 BMS986187的浓度的提高而减小，说明BMS986187是Delta阿片受体激动剂脑啡肽正向变构调节剂。

[0025]表1不同浓度BMS986187处理HEK293-Delta细胞5min后，根据不同浓度的脑啡肽在HEK293-Delta细胞上的RFU值计算得到的脑啡肽的EC50值
[0026]
[0027]本发明基于高通量实时荧光检测系统，建立了Delta阿片受体调节剂细胞筛选模型，此模型可高效可靠地筛选商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及化学修饰物，以获得Delta阿片受体调节剂及Delta阿片受体密切相关的中枢神经系统疾病，如成瘾、疼痛、抑郁、帕金森病、学习和认知等，和心脏病、缺血性中风、癌症等疾病的药物。

[0028]尽管已经示出和描述了本发的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

图1
图2。