热休克蛋白32对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织抗氧化能力的影响

热休克蛋白32对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织抗氧化能力的
影响
师婷;宋维芳
【摘要】Objective To investigate the antioxidant effect of heat shock protein 32(HSP32) on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Thirty-six male SD rats of clean grade weighing 220 - 250g were randomly divided into 3 groups ( n = 12 in each group) :sham operation group(S group) .ischemia and reperfusion group (IR group) ,and Znpp group(Z group). The focal cerebral ischemia-reperfusion model was established using nylon suture method of the right internal carotid artery to induce the middle cerebral artery occlusion. In Znpp group,the inhibitor of HSP32 Znpp 45 u,mol/kg was intraperitoneally injected in rats. All rats were sacrificed after 6 h reperfusion. Light microscope was used to observe the pathological changes of brain tissue. SOD activity, MDA content and HSP32 protein expression were detected in brain tissues. Results Compared with sham group,MDA significantly increased and SOD significantly decreased in the other two groups(P < 0.05). There was no significant difference in HSP32 expression between sham group and Znpp group (P>0.05) , while HSP32 expression was significantly higher in IR group than those in the other groups{P < 0.05 ). Compared with IR group, MDA significantly increased and SOD significantly decreased in Znpp group(P < 0.05 ). Conclusion Cerebral ischemia and reperfusion can induce the expression of heat shock protein 32 to reduce the oxidative damage
after reperfusion.%目的探讨热休克蛋白32( HSP32)在局灶性脑缺血再灌注损伤中的抗氧化作用. 方法将36只清洁级雄性SD大鼠随机分为3组,每组12只:假手术组(S组)、缺血再灌注组(IR组)和锌原卟啉IX(Znpp)+缺血再灌注组(Z组).采用右侧颈内动脉尼龙线线栓法致大脑中动脉栓塞法制备局灶性脑缺血再灌注模型.Z 组在造模前经腹腔注射HSP32特异性抑制剂Znpp(45 μmol/kg).所有大鼠再灌注6h后处死取脑,光镜下观察各组脑组织病理变化,检测脑组织中SOD活性、MDA 含量和HSP32蛋白表达. 结果与S组比,IR组和S组SOD显著降低(P＜
0.05),MDA显著升高(P＜0.05)；IR组HSP32蛋白的表达显著增多(P＜0.05),Z组HSP32的表达与S组差异无统计学意义(P＞0.05)；与IR组比,Z组MDA显著升高(P＜0.05),SOD显著降低(P＜0.05). 结论脑缺血再灌注可以诱导热休克蛋白32的表达,使再灌注后的氧化损伤减轻.
【期刊名称】《山西医科大学学报》
【年(卷),期】2012(043)003
【总页数】5页(P171-173,237-238)
【关键词】缺血再灌注损伤;热休克蛋白32;抗氧化
【作者】师婷;宋维芳
【作者单位】山西医科大学汾阳学院病理生理教研室, 汾阳 032200;山西医科大学汾阳学院病理生理教研室, 汾阳 032200
【正文语种】中文
【中图分类】R363
缺血性脑血管病的发病率逐年增高，对缺血缺氧敏感的脑组织需要及时恢复血流再灌注，但是缺血后再灌注引起机体氧化损伤，其后果比缺血本身引起的后果要严重，怎样抑制缺血再灌注的损伤成为焦点。

有研究表明［1］，HSP32的高表达有神经保护作用，本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型探讨HSP32在大鼠脑缺血再灌注损伤中的抗氧化作用。

1 材料与方法
1.1 实验动物与分组健康SD大鼠36只(山西医科大学实验动物中心提供)，雄性，体重220－250 g，鼠龄3－4个月，随机分为3组:假手术组(S组)、缺血再灌注
组(IR组)和锌原卟啉IX(Znpp)+缺血再灌注组(Z组)，每组12只。

1.2 主要试剂和仪器试剂:丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、
考马斯亮蓝试剂盒(均购自南京建成公司);锌原卟啉IX(Znpp，美国Sigma试剂公司)，HSP32兔抗鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司bs-0827R)，仪器:
医用氧气罐，微量高速离心机，721可见分光光度计(上海分析仪器总厂)，37℃恒温水浴箱，分析天平(上海第二天平仪器厂)。

1.3 模型制备制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，用10%水合氯醛350 mg/kg
腹腔注入麻醉后，将大鼠俯卧固定，备皮，消毒，参考郑晓影等［2］的方法用右侧颈内动脉尼龙线线栓法致大脑中动脉栓塞(MCAO)，动物麻醉后取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉;结扎颈总动脉、颈外动脉;于颈总动脉分
叉下方剪一切口，将一预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线(3－0，ETHICON，Japan)置入颈内动脉17－18 mm，直到有轻微阻力感为止。

阻闭120 min后抽出尼龙线，恢复再灌注。

假手术组(S组)麻醉后手术分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内
动脉，暴露120 min后缝合创口。

锌原卟啉(Znpp)+缺血再灌注组在麻醉后腹腔
注射Znpp 45 μmol/kg(溶于 DMSO 0.5 ml)，其余操作同缺血再灌注组。

模型成功的标志:①右侧Homer氏征;②左前肢瘫痪。

将鼠尾提起，大鼠不能充分伸展左前肢，当动物左旋时其左前肢拖在腹下，与右前肢交叉成剪刀状，行走时向左侧转圈。

造模时无上述体征的大鼠不计入实验。

假手术组无上述体征［3］。

1.4 标本采集和处理于再灌注6 h后用10%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，迅速剪开胸腔暴露心脏，于心尖处剪一小口，插入软管至主动脉，丝线结扎固定，剪开右心耳快速向心脏推注肝素化生理盐水，冲净血液后，以4%多聚甲醛灌流30 min，断头取脑，在冰面上沿大脑纵裂迅速分离两侧大脑半球，右侧1/2大脑半球自视交叉后1 mm处冠状切开，取右脑前脑部分，液氮冷冻后－70℃冰箱保存备用;左侧1/2置4%多聚甲醛固定，脱水，透明，石蜡包埋。

1.5 脑组织检测将标本置于4%多聚甲醛72 h后石蜡包埋，切片，常规HE染色后，40倍光镜下观察各组脑组织病理学变化。

免疫组织化学染色检测组织HSP32蛋白含量变化。

光学显微镜下，采用BI-2000医学图像分析系统对免疫组织化学切片结果进行观测，对于HSP32免疫阳性细胞的形态学观
测时以灰度值代表 HSP32蛋白表达，灰度值与HSP32蛋白含量成反比，灰度值越小说明蛋白含量越多，250倍光镜下所见细胞质为棕黄色为阳性细胞。

1.6 MDA含量和SOD活性测定将标本液氮冷冻后－70℃冰箱保存，匀浆，用考马斯亮蓝蛋白定量。

采用硫代巴比妥酸显色测定脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)含量;嘌呤氧化酶法测定抗氧化酶类超氧化物歧化酶(SOD)活力水平。

1.7 统计学分析实验数据以±s表示，所有数据进入SPSS13.0统计软件进行方差分析，数据进行正态性检验，组间进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用LSD法，检验水准取α=0.05，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组脑组织病理学变化 HE染色后，光镜下观察可见假手术组神经元数目多，细胞核大而清晰，核仁明显，胞质淡染。

Znpp组神经元数目大量减少，细胞核固
缩为三角形或多角形，胞质浓染。

IR组神经元数目有所减少，少量细胞形态正常，损伤情况介于这两者之间(见图1，见第237页)。

2.2 大鼠脑组织MDA含量和SOD活性的检测由表1可见，与假手术组比较，缺
血再灌注组和Znpp组大鼠脑组织匀浆SOD明显下降，MDA含量明显升高，差
异均有统计学意义(P＜0.05)。

与缺血再灌注组比较，Znpp组大鼠脑组织匀浆SOD明显下降，MDA含量明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 各组脑皮层组织HSP32蛋白表达的变化各组HSP32蛋白表达的灰度值见表1，缺血再灌注组组显著高于假手术组和Znpp组(P＜0.05)，S组和Z组间无显著差异(P＞0.05)。

光镜下免疫组化阳性细胞为棕黄色(见图2，见第238页)。

表1 各组脑组织MDA、SOD和HSP32的比较(±s)Tab 1 Comparison of MDA，SOD and HSP32 in brain tissues among three groups(±s)与假手术组比较，
*P＜0.05;与缺血再灌注组比较，#P＜0.05Znpp 组19.27±1.38*# 30.69±4.66*# 145.80±7.47#
图1 各组脑组织病理学变化(HE染色，×40)Fig 1 The pathological changes of brain tissues in each group(HE，×40)
图2 各组脑组织HSP32的表达，阳性细胞胞质为棕黄色(×250)Fig 2 Expression of HSP32 expression in brain tissues of each group(×250)
3 讨论
脑神经元中能量储备极少，对缺血、缺氧非常敏感，完全缺血很短时间后神经元就会发生不可逆的损害，所以减轻脑缺血再灌注损伤是人们一直致力解决的问题。

脑组织自身含有高浓度的不饱和脂肪酸，且需要相对较多的氧供应及脑内相对缺乏抗氧化防御系统，这些特点使得自由基对脑组织的损伤作用显得比较严重［4］。

因而脑缺血后，尤其是再灌注期，继发性自由基生成增多是造成神经元损伤的重要因素［5］。

MDA是脂质过氧化的最终产物，SOD是体内清除自由基的酶，所以进
行组织 SOD和MDA的检测可共同反映机体自由基的生成与清除情况。

本实验发现IR组大鼠脑缺血再灌后SOD活性下降，MDA含量上升，说明脑缺血再灌注后机体抗氧化系统受到破坏，自由基生成增多，清除不及时。

同时缺血再灌注模型大鼠行为学改变明显，病理学检测也显示神经元有一定程度的损伤，说明模型建立较成功。

HSP32即血红素氧合酶－1(HO-1)，是血红素氧合酶中唯一的一种诱导型酶，其
分子量是细胞适应和预防氧化应激反应的一种关键生物学物质［6］。

许多研究表明，HO-1高表达具有抗脏器缺血再灌注损伤的作用，但其保护机制尚未完全清楚。

目前机制多集中在HO-1降解血红素产生一氧化碳、胆绿素和Fe2+这些代谢产物上，胆红素是胆绿素的还原产物，是机体内天然的强抗氧化剂，可以有效地保护细胞膜拮抗脂质过氧化反应;Fe2+能诱导铁蛋白的合成，后者可减少活性氧的产生［7］;而CO是重要的细胞信号分子，具有抗炎症、抗凋亡及改善微循环等作用［6］。

本实验中，用抑制剂Znpp预处理脑缺血再灌注大鼠，HSP32表达降低，与IR组相比，Z组SOD活性下降，MDA含量上升，病理学损伤加重，说明Znpp抑制了HSP32的表达，使得其抗氧化损伤的能力降低，脑组织损伤严重。

综上所述，HSP32可以被缺血再灌注诱导，并且其在脑缺血再灌注损伤中有对抗
氧化损伤的作用。

参考文献:
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