DNA重组1-目的基因的获得
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平台效应出现的迟早 主要取决于起始模板 的拷贝数、所用的 的拷贝数、 DNA聚合酶的性能及 聚合酶的性能及 底物dNTP的浓度等多 底物 的浓度等多 种因素。 种因素。
（三）、PCR扩增DNA片段的方法 P59
（四）、常用的DNA片段PCR扩增 系统P60
三、DNA片段的化学合成
化学方法合成的DNA片段 片段 化学方法合成的
2、靶 DNA 和模板 、 双链片段。 靶 DNA：待扩增的特定 ：待扩增的特定DNA双链片段。 双链片段 应该知道其两端20 的核苷酸序列， 应该知道其两端 ～30bp的核苷酸序列， 的核苷酸序列 供设计一对引物之用。 供设计一对引物之用。
模板：一条单链的DNA片段 模板：一条单链的 片段
3、PCR引物 、 引物(Primer) 引物
– 目的基因的扩增与分离； 目的基因的扩增与分离； – 医疗诊断； 医疗诊断； – 基因突变与检测； 基因突变与检测； – 分子进化研究； 分子进化研究； – 环境检测； 环境检测； – 法医鉴定。 法医鉴定。
（一）、基本原理 ）、基本原理
变性
95˚C 95 C
90～95℃ ～ ℃ 30’’～1’ ～
DL-Dithiothreitol 中文名为二硫苏糖醇 分子式为C4H10O2S2 分子量为154.25
• 常用还原剂，有抗氧化作用。DTT和巯基乙醇相 比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多， 毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇 的浓度低7倍时，两者效果相近。但DTT价格略高 一些。 还原性 DTT是一种很强的还原剂，其还原性很大程度上 是由于其氧化状态六元环（含二硫键）的构象稳 定性。它的氧化还原电势在pH为7时为-0.33伏。
第四章
DNA重组（目的基因的获得）
• 限制性核酸内切酶（工具酶已经介绍）
一、DNA分子片段化
天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段， 天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段， DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段 DNA分子的片段化 常用的切割方法有单酶切 分子的片段化。 单酶切、 即DNA分子的片段化。常用的切割方法有单酶切、双酶 部分酶切等方法 等方法。 切和部分酶切等方法。 1. 2. 3. 单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品。 单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品。最常 DNA样品 用。 双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。 双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。 DNA分子 部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分 部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分 DNA 子上的全部识别序列进行不完全的切割。 子上的全部识别序列进行不完全的切割。
7、PCR扩增的平台效应 、 扩增的平台效应
– 在PCR反应中，当引物－模板与 反应中， 反应中 当引物－模板与DNA聚合 聚合 酶达到一定比值时， 酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化的反 聚合酶催化的反 应趋于饱和，会出现“平台效应”，即 应趋于饱和，会出现“平台效应” PCR反应产物不再增加。 反应产物不再增加。 反应产物不再增加
70～75℃ ～ ℃ 30’’～2’ ～
延伸 72˚C
退火
Tm- C Tm-5˚C
37～60℃ ～ ℃ 30’’～1’ ～
动画
（二）、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件 ）、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件 PCR扩增特异性DNA
耐热性DNA DNA聚合酶 1、耐热性DNA聚合酶
聚合酶(无校对功能 ①Taq DNA聚合酶 无校对功能 聚合酶 无校对功能) 功能： 功能： 聚合酶活性， 有5’ →3’DNA聚合酶活性， 5’ →3’DNA外切酶活性 聚合酶活性 外切酶活性 无3’→ 5’ DNA外切酶活性 外切酶活性 特点： 特点： 活性在pH9左右（20℃）和温度 ℃左右的反应条件下最 左右（ ℃ 和温度75 活性在 左右 处理后仍保持活性； 高，95 ℃处理后仍保持活性； 即使100 ℃处理 处理5min，仍具一半活性 即使 ，
• 应用 DTT的用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护 剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体， 特别是在存在氧气的情况下。这种二聚化大大降低了一些 偶联反应实验（如DNA在生物感应器中的固定）的效率； 而在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除去，就可以 降低DNA的二聚化。 DNA • DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻 止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子 间二硫键。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部 （溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先 将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M 盐酸胍、 8M 尿素或1% SDS）。反之，根据DTT存在情况下，二硫 键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。
具体的设计原则：
• 引物 端必须具有游离-OH基团； 引物3’端必须具有游离 基团； 端必须具有游离 基团 • 引物长度 引物长度20-30个核苷酸，G+C含量一般为 个核苷酸， 含量一般为40%~60%，四 个核苷酸 含量一般为 ， 种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在； 种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在； • 引物应避免回文结构，同时引物之间也不能有互补性 ， 引物应避免回文结构， 避免形成引物二聚体； 避免形成引物二聚体； • 5’端可以修饰，如加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、 端可以修饰，如加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、 端可以修饰 地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。 地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能 端绝对不能 进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的 端开始的。 进行任何修饰，因为引物的延伸是从 端开始的。
④C.therm. DNA聚合酶 聚合酶 (RT-PCR、有校对功能 、有校对功能)
功能： 功能： 聚合酶活性； 有5’ →3’DNA聚合酶活性；3’→ 5’ DNA外切酶活性 聚合酶活性 外切酶活性 特点： 特点： Mg2+存在时，有反转录酶活性，RNA → cDNA 存在时， 反转录酶活性 活性， 合成cDNA的准确度比 合成 的准确度比Tth DNA聚合酶高 倍 聚合酶高2倍 的准确度比 聚合酶高
聚合酶(有校对功能 ②Pwo DNA聚合酶 有校对功能 聚合酶 有校对功能)
功能： 功能： 聚合酶活性， 有5’ →3’DNA聚合酶活性，3’→ 5’ DNA外切酶活性 聚合酶活性 外切酶活性 无5’ →3’DNA外切酶活性 外切酶活性 特点： 特点： 耐热性更高， 处理2h，仍具一半活性； 耐热性更高， 100 ℃处理 ，仍具一半活性； 更高 准确度比 聚合酶高10倍 准确度比Taq DNA聚合酶高 倍； 聚合酶高 扩增的DNA片段是平末端的。 片段是平末端 扩增的 片合成的一段由8~12个核苷 个核苷 酸组成， 酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平 末端的双链寡核苷酸片段。 末端的双链寡核苷酸片段。 linker经限制酶切割后可产生一定的粘末端，可与 经限制酶切割后可产生一定的粘末端， 经限制酶切割后可产生一定的粘末端 另一有相同粘末端的DNA片段连接。 片段连接。 另一有相同粘末端的 片段连接 由几十至上百个核苷酸组成， 由几十至上百个核苷酸组成，有多种限制酶的识别 序列， 序列，可作为连杆且被组装在克隆载体上成为 多克隆位点（ ）。这种连杆即 多克隆位点（MCS）。这种连杆即多克隆位点 ）。这种连杆即多克隆位点 寡核苷酸连杆或简称MCS连杆。 连杆。 寡核苷酸连杆或简称 连杆
Taq DNA聚合酶，Pwo DNA聚合酶 聚合酶， 聚合酶 聚合酶 将喜温性细菌中此酶的基因转入E.coli细胞， 将喜温性细菌中此酶的基因转入 细胞， 细胞 市售产品为此酶基因在E.coli细胞中的表达 市售产品为此酶基因在 细胞中的表达 产物。 产物。 Tth DNA聚合酶，C.therm. DNA聚合酶 聚合酶， 聚合酶 聚合酶 直接从发现它们的微生物中提取
• 扩增编码区域时，引物3′端不要终止于密码子 扩增编码区域时，引物 端不要终止于密码子 的第3位 因为密码子第3位易发生简并， 位易发生简并 的第 位，因为密码子第 位易发生简并，会影 响扩增的特异性与效率 ； • 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70% 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 或有连续8个互补碱基同源 或有连续 个互补碱基同源
– PCR扩增引物：是指与待扩增 扩增引物： 扩增引物 是指与待扩增DNA区域两 区域两 端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段， 端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段， 其长度通常在16～ 个核苷酸之间 个核苷酸之间。 其长度通常在 ～24个核苷酸之间。它包括 引物1和引物 和引物2。 引物 和引物 。 – 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增 效率和特异性， 效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩 增。
聚合酶(RT-PCR) ③Tth DNA聚合酶 聚合酶
功能： 功能： 有强5’ →3’DNA聚合酶活性； 聚合酶活性； 聚合酶活性 无3’→ 5’ DNA外切酶活性 外切酶活性 特点： 特点： Mn2+存在时，有强反转录酶活性，RNA → cDNA 存在时，有强反转录酶活性， 反转录酶活性 Mg2+存在时，cDNA可继续进行 存在时， 可继续进行PCR扩增 可继续进行 扩增 反转录-聚合酶链式反应 ），扩 可被用于反转录 聚合酶链式反应（ ）， 可被用于反转录 聚合酶链式反应（RT-PCR），扩 增至少1000bp长的 长的cDNA片段 增至少 长的 片段
4、PCR原材料 、 原材料 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP 、 、 、 或修饰过的核苷酸 5、PCR缓冲液 、 缓冲液 140mM Tris-Hcl（pH8.8）、 （ ） 4 ～8mM MgCl2、 40mM (NH4)2SO4、 30µg/ml BSA(无核酸酶 、[牛血清蛋白 无核酸酶)、 牛血清蛋白 牛血清蛋白(BSA）] 无核酸酶 ） 16mM DTT [ 二硫苏糖醇 二硫苏糖醇]
6、PCR循环的温度和时间 、 循环的温度和时间 （1）变性（快速高温） ）变性（快速高温） 温度： 多采用94 温度：90 ～ 95 ℃，多采用 ℃ 时间： 时间：20s （2）复性 ） 温度：取决于引物长短和GC含量 温度：取决于引物长短和 含量 如长度20个核苷酸 个核苷酸， 含量 含量50% → 55 ℃； 如长度 个核苷酸，GC含量 如长度12 个核苷酸→ ～ 如长度 ～15个核苷酸 40～ 45 ℃； 个核苷酸 时间： 时间：20s （3）延伸 ） 温度： 温度： 70 ～ 75 ℃ 时间：随扩增DNA片段长度而定 时间：随扩增 片段长度而定 1000bp→1min，<150bp甚至不需考虑延伸时间 ， 甚至不需考虑延伸时间
• 即PCR技术，由美国科学家Mullis于1983年 PCR技术 由美国科学家Mullis 1983年 技术， Mullis于 发明，又称基因的体外扩增法 基因的体外扩增法。 发明，又称基因的体外扩增法。 • 也有人称无细胞分子克隆法。 也有人称无细胞分子克隆法 无细胞分子克隆法。
•
PCR技术的用途 PCR技术的用途
DNA互补链的引物、 互补链的引物、 互补链的引物 寡核苷酸连杆 基因片段 基因元件
合成DNA DNA互补链的引物 1. 合成DNA互补链的引物
• PCR引物外 还有测序引物。见下表。 引物外， 除PCR引物外，还有测序引物。见下表。
2. DNA寡核苷酸连杆（linker） 寡核苷酸连杆（ 寡核苷酸连杆 ）
DNA分子的限制性图谱
• 限制酶图谱 map） （restriction map）: • 描述染色体上限制性 内切酶切割位点之间 距离和顺序的图谱 的图谱。 距离和顺序的图谱。
特异性DNA片段的PCR DNA片段的PCR扩增 二、 特异性DNA片段的PCR扩增
聚合酶链式反应 reaction） （polymerase chain reaction）
（三）、PCR扩增DNA片段的方法 P59
（四）、常用的DNA片段PCR扩增 系统P60
三、DNA片段的化学合成
化学方法合成的DNA片段 片段 化学方法合成的
2、靶 DNA 和模板 、 双链片段。 靶 DNA：待扩增的特定 ：待扩增的特定DNA双链片段。 双链片段 应该知道其两端20 的核苷酸序列， 应该知道其两端 ～30bp的核苷酸序列， 的核苷酸序列 供设计一对引物之用。 供设计一对引物之用。
模板：一条单链的DNA片段 模板：一条单链的 片段
3、PCR引物 、 引物(Primer) 引物
– 目的基因的扩增与分离； 目的基因的扩增与分离； – 医疗诊断； 医疗诊断； – 基因突变与检测； 基因突变与检测； – 分子进化研究； 分子进化研究； – 环境检测； 环境检测； – 法医鉴定。 法医鉴定。
（一）、基本原理 ）、基本原理
变性
95˚C 95 C
90～95℃ ～ ℃ 30’’～1’ ～
DL-Dithiothreitol 中文名为二硫苏糖醇 分子式为C4H10O2S2 分子量为154.25
• 常用还原剂，有抗氧化作用。DTT和巯基乙醇相 比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多， 毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇 的浓度低7倍时，两者效果相近。但DTT价格略高 一些。 还原性 DTT是一种很强的还原剂，其还原性很大程度上 是由于其氧化状态六元环（含二硫键）的构象稳 定性。它的氧化还原电势在pH为7时为-0.33伏。
第四章
DNA重组（目的基因的获得）
• 限制性核酸内切酶（工具酶已经介绍）
一、DNA分子片段化
天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段， 天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段， DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段 DNA分子的片段化 常用的切割方法有单酶切 分子的片段化。 单酶切、 即DNA分子的片段化。常用的切割方法有单酶切、双酶 部分酶切等方法 等方法。 切和部分酶切等方法。 1. 2. 3. 单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品。 单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品。最常 DNA样品 用。 双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。 双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。 DNA分子 部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分 部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分 DNA 子上的全部识别序列进行不完全的切割。 子上的全部识别序列进行不完全的切割。
7、PCR扩增的平台效应 、 扩增的平台效应
– 在PCR反应中，当引物－模板与 反应中， 反应中 当引物－模板与DNA聚合 聚合 酶达到一定比值时， 酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化的反 聚合酶催化的反 应趋于饱和，会出现“平台效应”，即 应趋于饱和，会出现“平台效应” PCR反应产物不再增加。 反应产物不再增加。 反应产物不再增加
70～75℃ ～ ℃ 30’’～2’ ～
延伸 72˚C
退火
Tm- C Tm-5˚C
37～60℃ ～ ℃ 30’’～1’ ～
动画
（二）、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件 ）、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件 PCR扩增特异性DNA
耐热性DNA DNA聚合酶 1、耐热性DNA聚合酶
聚合酶(无校对功能 ①Taq DNA聚合酶 无校对功能 聚合酶 无校对功能) 功能： 功能： 聚合酶活性， 有5’ →3’DNA聚合酶活性， 5’ →3’DNA外切酶活性 聚合酶活性 外切酶活性 无3’→ 5’ DNA外切酶活性 外切酶活性 特点： 特点： 活性在pH9左右（20℃）和温度 ℃左右的反应条件下最 左右（ ℃ 和温度75 活性在 左右 处理后仍保持活性； 高，95 ℃处理后仍保持活性； 即使100 ℃处理 处理5min，仍具一半活性 即使 ，
• 应用 DTT的用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护 剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体， 特别是在存在氧气的情况下。这种二聚化大大降低了一些 偶联反应实验（如DNA在生物感应器中的固定）的效率； 而在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除去，就可以 降低DNA的二聚化。 DNA • DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻 止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子 间二硫键。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部 （溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先 将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M 盐酸胍、 8M 尿素或1% SDS）。反之，根据DTT存在情况下，二硫 键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。
具体的设计原则：
• 引物 端必须具有游离-OH基团； 引物3’端必须具有游离 基团； 端必须具有游离 基团 • 引物长度 引物长度20-30个核苷酸，G+C含量一般为 个核苷酸， 含量一般为40%~60%，四 个核苷酸 含量一般为 ， 种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在； 种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在； • 引物应避免回文结构，同时引物之间也不能有互补性 ， 引物应避免回文结构， 避免形成引物二聚体； 避免形成引物二聚体； • 5’端可以修饰，如加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、 端可以修饰，如加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、 端可以修饰 地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。 地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能 端绝对不能 进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的 端开始的。 进行任何修饰，因为引物的延伸是从 端开始的。
④C.therm. DNA聚合酶 聚合酶 (RT-PCR、有校对功能 、有校对功能)
功能： 功能： 聚合酶活性； 有5’ →3’DNA聚合酶活性；3’→ 5’ DNA外切酶活性 聚合酶活性 外切酶活性 特点： 特点： Mg2+存在时，有反转录酶活性，RNA → cDNA 存在时， 反转录酶活性 活性， 合成cDNA的准确度比 合成 的准确度比Tth DNA聚合酶高 倍 聚合酶高2倍 的准确度比 聚合酶高
聚合酶(有校对功能 ②Pwo DNA聚合酶 有校对功能 聚合酶 有校对功能)
功能： 功能： 聚合酶活性， 有5’ →3’DNA聚合酶活性，3’→ 5’ DNA外切酶活性 聚合酶活性 外切酶活性 无5’ →3’DNA外切酶活性 外切酶活性 特点： 特点： 耐热性更高， 处理2h，仍具一半活性； 耐热性更高， 100 ℃处理 ，仍具一半活性； 更高 准确度比 聚合酶高10倍 准确度比Taq DNA聚合酶高 倍； 聚合酶高 扩增的DNA片段是平末端的。 片段是平末端 扩增的 片合成的一段由8~12个核苷 个核苷 酸组成， 酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平 末端的双链寡核苷酸片段。 末端的双链寡核苷酸片段。 linker经限制酶切割后可产生一定的粘末端，可与 经限制酶切割后可产生一定的粘末端， 经限制酶切割后可产生一定的粘末端 另一有相同粘末端的DNA片段连接。 片段连接。 另一有相同粘末端的 片段连接 由几十至上百个核苷酸组成， 由几十至上百个核苷酸组成，有多种限制酶的识别 序列， 序列，可作为连杆且被组装在克隆载体上成为 多克隆位点（ ）。这种连杆即 多克隆位点（MCS）。这种连杆即多克隆位点 ）。这种连杆即多克隆位点 寡核苷酸连杆或简称MCS连杆。 连杆。 寡核苷酸连杆或简称 连杆
Taq DNA聚合酶，Pwo DNA聚合酶 聚合酶， 聚合酶 聚合酶 将喜温性细菌中此酶的基因转入E.coli细胞， 将喜温性细菌中此酶的基因转入 细胞， 细胞 市售产品为此酶基因在E.coli细胞中的表达 市售产品为此酶基因在 细胞中的表达 产物。 产物。 Tth DNA聚合酶，C.therm. DNA聚合酶 聚合酶， 聚合酶 聚合酶 直接从发现它们的微生物中提取
• 扩增编码区域时，引物3′端不要终止于密码子 扩增编码区域时，引物 端不要终止于密码子 的第3位 因为密码子第3位易发生简并， 位易发生简并 的第 位，因为密码子第 位易发生简并，会影 响扩增的特异性与效率 ； • 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70% 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 或有连续8个互补碱基同源 或有连续 个互补碱基同源
– PCR扩增引物：是指与待扩增 扩增引物： 扩增引物 是指与待扩增DNA区域两 区域两 端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段， 端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段， 其长度通常在16～ 个核苷酸之间 个核苷酸之间。 其长度通常在 ～24个核苷酸之间。它包括 引物1和引物 和引物2。 引物 和引物 。 – 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增 效率和特异性， 效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩 增。
聚合酶(RT-PCR) ③Tth DNA聚合酶 聚合酶
功能： 功能： 有强5’ →3’DNA聚合酶活性； 聚合酶活性； 聚合酶活性 无3’→ 5’ DNA外切酶活性 外切酶活性 特点： 特点： Mn2+存在时，有强反转录酶活性，RNA → cDNA 存在时，有强反转录酶活性， 反转录酶活性 Mg2+存在时，cDNA可继续进行 存在时， 可继续进行PCR扩增 可继续进行 扩增 反转录-聚合酶链式反应 ），扩 可被用于反转录 聚合酶链式反应（ ）， 可被用于反转录 聚合酶链式反应（RT-PCR），扩 增至少1000bp长的 长的cDNA片段 增至少 长的 片段
4、PCR原材料 、 原材料 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP 、 、 、 或修饰过的核苷酸 5、PCR缓冲液 、 缓冲液 140mM Tris-Hcl（pH8.8）、 （ ） 4 ～8mM MgCl2、 40mM (NH4)2SO4、 30µg/ml BSA(无核酸酶 、[牛血清蛋白 无核酸酶)、 牛血清蛋白 牛血清蛋白(BSA）] 无核酸酶 ） 16mM DTT [ 二硫苏糖醇 二硫苏糖醇]
6、PCR循环的温度和时间 、 循环的温度和时间 （1）变性（快速高温） ）变性（快速高温） 温度： 多采用94 温度：90 ～ 95 ℃，多采用 ℃ 时间： 时间：20s （2）复性 ） 温度：取决于引物长短和GC含量 温度：取决于引物长短和 含量 如长度20个核苷酸 个核苷酸， 含量 含量50% → 55 ℃； 如长度 个核苷酸，GC含量 如长度12 个核苷酸→ ～ 如长度 ～15个核苷酸 40～ 45 ℃； 个核苷酸 时间： 时间：20s （3）延伸 ） 温度： 温度： 70 ～ 75 ℃ 时间：随扩增DNA片段长度而定 时间：随扩增 片段长度而定 1000bp→1min，<150bp甚至不需考虑延伸时间 ， 甚至不需考虑延伸时间
• 即PCR技术，由美国科学家Mullis于1983年 PCR技术 由美国科学家Mullis 1983年 技术， Mullis于 发明，又称基因的体外扩增法 基因的体外扩增法。 发明，又称基因的体外扩增法。 • 也有人称无细胞分子克隆法。 也有人称无细胞分子克隆法 无细胞分子克隆法。
•
PCR技术的用途 PCR技术的用途
DNA互补链的引物、 互补链的引物、 互补链的引物 寡核苷酸连杆 基因片段 基因元件
合成DNA DNA互补链的引物 1. 合成DNA互补链的引物
• PCR引物外 还有测序引物。见下表。 引物外， 除PCR引物外，还有测序引物。见下表。
2. DNA寡核苷酸连杆（linker） 寡核苷酸连杆（ 寡核苷酸连杆 ）
DNA分子的限制性图谱
• 限制酶图谱 map） （restriction map）: • 描述染色体上限制性 内切酶切割位点之间 距离和顺序的图谱 的图谱。 距离和顺序的图谱。
特异性DNA片段的PCR DNA片段的PCR扩增 二、 特异性DNA片段的PCR扩增
聚合酶链式反应 reaction） （polymerase chain reaction）