肿瘤动物模型“新宠“——PDTX篇

肿瘤动物模型“新宠“——PDTX篇
导读近年来，随着“肿瘤精准医疗”概念的提出，一种新的肿瘤模型应运而生，并被称为“目前最接近人类临床实际情况的肿瘤模型”，它对肿瘤新药研发、靶点筛选及个性化治疗起着重大推动作用。

它就是我们本期主角：人源肿瘤组织异种移植模型（PDTX），本文就为大家详细介绍这种PDTX模型的应用和常见PDTX模型的建立。

什么是PDTX模型？
PDTX（Patient-derived tumor xenograft）即人源性肿瘤组织异种移植模型，又名PDX。

指将肿瘤患者的新鲜肿瘤组织移植（异位或原位）到免疫缺陷鼠（NOD/SCID、NRG小鼠等）上，在小鼠上培育出人的肿瘤组织。

该模型保持了人源肿瘤的原始多样性，更好地模拟了肿瘤细胞在人体内的生长环境[1]。

PDTX模型与CDTX比较，优势在哪里？
CDTX（肿瘤细胞系移植模型）一直是我们往期内容的主角，它因易构建、成瘤率高、周期短等优点而被广泛应用，然而却依然存在一些缺陷而无法接近临床病人肿瘤的实际情况。

最大的缺陷就是CDTX缺乏肿瘤异质性！
CDTX也可称为传统的荷瘤模型，即使用传统的体外处理过的永生化肿瘤细胞系移植小鼠，由于这类细胞的同质性，缺少细胞外基质、非肿瘤细胞等肿瘤微环境，使得肿瘤移植后难以有临床组织病理特征。

因此所得出的药物剂量范围、疗效与实际临床会有较大出入[2]。

就在去年，美国国家癌症研究所（NCI）宣布被全世界使用了25
年的NCI-60（在培养基中生长的60种人类癌细胞系）从其药物筛选程序中“退休”，并决定将启动一个得到更新的、来源于病人新鲜样本的癌症模型库。

如下表为PDTX与CDTX的比较：
PDTX的应用
1. 药物筛选：经过近几十年的研究，发现PDTX模型进行药物筛选的结果跟临床的相关性非常高，所以很多研究单位和制药企业都纷纷采用PDTX模型进行肿瘤药物的筛选和评估，得出更加合理有效的治疗方案[3]。

2. 肿瘤个性化治疗：同一肿瘤在不同患者上发展情况不同，加上同一肿瘤还有许多分型，因此选择的治疗方法也不相同。

通过取不同患者自身组织建立PDTX模型进行药物敏感性研究，可很好预测每个患者对药物是否敏感，有利于提高药物治疗的针对性，给患者带来更大的临床受益。

3. 发现分子标记：PDTX 模型的肿瘤组织可以保存和传代，为肿瘤发生机制及潜在治疗靶点的探究提供了非常宝贵的标本。

目前NCI 已建立了超过300例PDTX模型，Jax Lab约450例。

如下图所示：
PDTX模型在临床药物评价的应用[4]
那么，如何进行PDTX模型构建呢？
基本过程：取肿瘤患者（知情且同意）的新鲜肿瘤组织剪成小块移植到免疫缺陷小鼠（如nude，NOD/scid，NSG）。

一般为了获得更多更贴近人类的实验样本，需多次传代。

如下图所示：一般将患者的肿瘤组织作为F0代或G0代；第一次荷瘤小鼠称为F1或G1代；再次移植来自F1代肿瘤块的小鼠为F2或G2代，命名依次类推F3…Fn，经过一代代扩增，就可得到大量荷瘤小鼠样本。

PDTX模型基本构建过程[5]
一般模型构建中，F1代成功移植率偏低，后续移植成功率会逐渐提高，可接近100%。

一般F3代可用于实验，且大多数研究不超过F5代。

当然也因不同肿瘤而异，如有研究表明，通过全基因组测序，发现结肠癌的F3 代PDTX与F0代相关性最高，乳腺癌则是F3代。

PDTX模型的常见类型
一般根据移植部位的不同，分为原位Orthotopic和异位Heterotopic移植（皮下移植，肾包膜移植等），下面依次介绍。

一、异位之皮下移植（Subcutaneous PDTX model）
与细胞荷瘤一样，将组织移植于免疫缺陷小鼠皮下，移植部位一般选择血液丰富的位置，如腋下、腹股沟、侧腹部等。

评价：最为常用且操作简单的移植方法，但一般局限于皮下生长，很少出现转移，因此不适合研究肿瘤在原位组织的生长及转移情况且成功率在部分肿瘤中很低，如前列腺癌仅2/150。

下面以肺癌为例讲述皮下PDTX的构建过程：
1.处理新鲜肺癌组织F0：在无菌条件下的冰上对新鲜离体的肺癌肿瘤组织，剔除包膜及坏死组织，切成约15mm3（2mm×2mm×3mm）的小块；
2.首次接种小鼠F1：将切好的组织碎片用镊子填入定制的套管针尖端内，注射到5-6周NOD/SCID重症联合免疫缺陷小鼠背部皮下，每只老鼠背部可以接种1-2个位点，每例肿瘤接种2-3只小鼠，此接种过程须在肿瘤标本离体后2h之内完成，为提高成瘤率肿瘤块也可混合10% Matrigel进行荷瘤；
3.再次传代F1：当裸鼠皮下肿瘤生长至1000 mm3左右，表示移植成功，对其处于对数增长期的原代皮下移植小鼠模型进行传代；
4.剥离皮下肿瘤，部分组织速冻至液氮备用或经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋；
5.另一部分则传F2代：按上述接种步骤，移植到4-5只裸鼠皮下；
6.按照此流程，在裸鼠体内连续传3代后，移植瘤的生长速度开始稳定，可进行动物实验。

7.后续试验分析：如下图为皮下接种KRAS突变的非小细胞肺癌
的F3代PDTX模型，对照组和给药组的比较。

非小细胞肺癌的F3代PDTX模型[6]
二、异位之肾包膜移植（Subrenal capsule, SRC PDTXmodels)
SRC PDTX是将人体新鲜肿瘤移植于免疫缺陷鼠肾包膜下，由于肾包膜血管丰富等优势，为一些皮下难以成瘤的模型开辟了一个新途径。

如非小细胞肺癌NSCLC的肾包膜成功率高达90%，皮下仅为25%。

评价：肾包膜下移植成功率很高，且与人类肿瘤生长很相近。

但操作难度较大，小鼠肾脏较小且包膜脆弱，易失败，并且会造成小鼠感染而死亡；加上该移植不能直观观察肿瘤的大小，限制了其应用范围。

如下图为肾包膜下的前列腺癌PDTX：上为移植正常组织，下为移
植癌组织，可见肿瘤组织在肾包膜处生长良好，并衍生出很多血管。

肾包膜下的前列腺癌PDTX模型[7]
三、原位移植（Orthotopic PDTX models)
将患者肿瘤组织移植在原位，以模拟肿瘤在患者体内的生长及转移过程。

目前已在多种肿瘤中构建成功用于药物筛选。

评价：可发生近端或远端转移，是最贴近人类肿瘤生长模式的移植。

但是操作比较困难，且肿瘤处于原位不易观察，需要借助活体成像，因此限制了它的使用。

如乳腺癌PDTX模型已被多次报道，由于乳房垫的营养丰富，操作相对简单，因此移植比较成功率高且会发生转移。

其操作步骤与皮下主要差异在于荷瘤位置位于乳房垫，具体步骤不再赘述。

注意事项：
1.移植肿瘤组织的特性及处理过程对移植的成功率影响较大，需
特别注意标本的新鲜度及标本离体后到移植之间的时间跨度必须控制在2h内；
2.传代时接种的瘤块尽可能保持均一，防止个体差异过大；
3.乳房垫接种位置较小，瘤块不可过大，尽量剪小，防止接种后移位；
4.为提高成瘤率肿瘤块也可混合10% Matrigel进行荷瘤。

四、新一代PDTX模型（人源化免疫系统的PDTX）
以上PDTX必须选择免疫缺陷的小鼠才可保证建立模型的成功率。

然而这无法研究免疫系统相关的疾病，如研究PD-1抗体的小鼠。

为此，研究人员一直在摸索中前进，如下图为目前构建的人源化可评价免疫效果的PDTX模型：
人源化免疫系统的PDTX的构建过程[8]
基本原理：首先在免疫缺陷小鼠上移植病人来源的肿瘤，待成瘤以后，通过静脉注射分离自病人的（最好是同一病人来源的）肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）、外周血单核细胞（PBMC）或CD34阳性造血干细胞（HSC），并通过补充特定类型细胞因子，诱导细胞定向分化为T 细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞等，在小鼠体内重建起人源化的免疫系统，以用于免疫治疗相关的研究，目前该模型已被多次报道[8]。

PDTX模型可称得上肿瘤患者试药的“完美替身”，极大地推动了肿瘤个性化治疗和药物筛选，具有重大的临床意义。

本期我们为大家介绍了PDTX模型的应用价值和几种常见的模型构建，欢迎大家互相学习和讨论。

参考文献：
1. Gao, H. et al. High-throughput screening using patient derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat. Med. 21, 1318–1325 (2015).
2. Daniel, V. C. et al. A primary xenograft model of smallcell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364–3373 (2009).
3. Tentler J J, Tan A C, Weekes C D, et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2012, 9(6): 338-350.
4. Hidalgo M, Amant F, Biankin A V, et al. Patient-Derived Xenograft Models: An Emerging Platform for Translational Cancer Research[J]. Cancer Discovery, 2014, 4(9): 998-1013.
5. Pitts, T. M. et al. Development of an integrated genomic classifier for a novel agent in colorectal cancer: approach to
individualized therapy in early development. Clin. Cancer Res. 16, 3193–3204 (2010).
6. Wang J, Hu K, Guo J, et al. Suppression of KRas-mutant cancer through the combined inhibition of KRAS with PLK1 and ROCK[J]. Nature Communications,2016: 11363-11363.
7. Priolo C, Agostini M, Vena N, et al. Establishment and Genomic Characterization of Mouse Xenografts of Human Primary Prostate Tumors.[J]. American Journal of Pathology, 2010, 176(4): 1901-1913.
8. Annette T. Byrne, Denis G, et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer 17, 254–268 (2017)
精彩内容列表（持续更新）
模式动物系列（—）大小鼠基本信息
1.1 常见大小鼠品系
1.2 如何进行小鼠科学地饲养
1.3 小鼠的一生及繁育过程
1.4 ICR小鼠介绍
1.5 小鼠隔离与净化
1.6 常见小鼠实验操作技能（小鼠的抓取与固定、给药方式等）
1.7 尾静脉注射实验技巧
1.8 大鼠信息介绍
2. 模式动物系列（二）基因编辑鼠
（一）基因编辑鼠的构建流程
2.1 基因编辑鼠的构建
2.2 gRNA设计和筛选
2.3 sgRNA表达载体构建
2.4 显微注射操作步骤及要点
2.5 小鼠培育及繁殖过程
2.6 小鼠基因型鉴定
2.7 小鼠保种方式（精子、胚胎冻存）
2.8 小鼠体外受精介绍
（二）基因编辑鼠的发展与分类
2.9 基因编辑小鼠的发展过程
3.0 如何选择正确的基因编辑小鼠
3.01 基因敲除（KO)小鼠的原理、构建与应用
3.02 基因敲入（KI)小鼠的原理、构建与应用
3.03 条件性敲除小鼠（CKO）的原理、构建与应用3.04 条件性敲入鼠（CKI）的原理、构建与应用3.05 Cre鼠的原理、构建与应用
3.06 转基因小鼠的原理、构建与应用
3.07 如何查找基因序列
3. 模式动物系列（三）疾病动物模型
（一）疾病动物模型概况
3.1 疾病动物模型基本介绍
3.2 免疫缺陷动物
3.3 人源化动物
3.4 肿瘤动物模型介绍
3.5 肿瘤模型之生长、转移及复发模型
3.6 免疫疗法相关肿瘤模型介绍
（二）肿瘤动物模型的构建
3.7 如何正确地选择肿瘤动物模型？
3.8 移植性肿瘤模型的建立之皮下荷瘤
3.9 肿瘤转移动物模型的构建（上）
4.0 肿瘤转移动物模型的构建（下）
4.01 肺癌动物模型的构建
4.02 乳腺癌动物模型构建
4.03 结直肠癌动物模型构建
4.04 前列腺癌动物模型构建
4.05 淋巴瘤动物模型构建
4.06 肝癌动物模型构建
4.07 白血病动物模型构建
4.08 骨肉瘤动物模型构建
4.09 皮肤癌动物模型构建
4.09 黑色素瘤动物模型构建
4.091 神经胶质瘤动物模型构建
4.092 肝病动物模型构建
4. 实践中的实验动物福利和伦理
4.1 Nature论文险被撤稿，你的动物实验合乎动物福利和伦理吗？
4.2 实验动物的基本福利与伦理概述
5. 小鼠命名规则
5.1 常见小鼠命名规则
5.2 基因工程鼠命名规则（上）——定点突变小鼠
5.3 基因工程鼠命名规则（下）——转基因小鼠
6. 代谢综合征动物模型
6.1 糖尿病动物模型综述
6.2 1型糖尿病动物模型介绍
6.3 2型糖尿病动物模型介绍
6.4 肝损伤动物模型介绍。