pH偏移结合温和热处理对蚕豆分离蛋白结构和功能的影响

pH偏移结合温和热处理对蚕豆分离蛋白结构和功能的影响周向军;董瑞红;高义霞
【摘要】研究pH偏移结合温和热处理对蚕豆分离蛋白(broad bean protein isolate,BBPI)结构和功能的影响.BBPI在pH1.5结合25、37和55℃条件下,分别处理0、1.5、3.5和5.5h后,逐渐恢复至中性,分析其溶解性、乳化性、巯基/总巯基含量、紫外、荧光光谱、表面疏水性、二级结构含量和微结构变化.结果表明:随时间延长,BBPI溶解性和乳化性均先降低后增加,37和55℃处理组巯基含量先增加后降低,25℃处理组则变化不大.随时间延长,37℃处理组总巯基含量先增加后迅速下降,25和55℃先平稳后降低.紫外和荧光光谱表明,随时间延长,25℃处理的大部分色氨酸残基包裹在分子内部疏水微环境,37℃处理组的色氨酸残基部分解折叠.25和37℃处理时,BBPI的表面疏水性先增加后降低,55℃处理则先增加后出现波动.随温度增加,BBPI的α-螺旋和β-折叠逐渐转化为β-转角和无规则卷曲,形成粒径约80～130 nm的球状体且存在团聚.pH偏移结合温和热处理在一定程度上可改变蚕豆分离蛋白的结构和功能.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2019(045)001
【总页数】9页(P100-108)
【关键词】蚕豆分离蛋白;pH偏移;热处理;结构
【作者】周向军;董瑞红;高义霞
【作者单位】天水师范学院生物工程与技术学院,甘肃天水,741001;天水师范学院
生物工程与技术学院,甘肃天水,741001;天水师范学院生物工程与技术学院,甘肃天水,741001
【正文语种】中文
蚕豆(Vicia faba L.)，豆科巢菜属草本作物，富含淀粉、蛋白质、纤维素、维生素、矿物质、原花色素及异黄酮等生物活性物质。

我国是世界上蚕豆种植面积和总产量最大的国家，分别占世界37.3%和32.6%[1]。

蚕豆蛋白含量高达25%～30%[2]，仅次于大豆蛋白，含有人体必需的8种氨基酸，其氨基酸组成与人体所必需氨基
酸比例接近，是一种优质的植物蛋白资源[3]，被认为未来最有可能取代肉类蛋白[4]。

处于极端pH条件下的蛋白质，其分子内部结构首先展开，逐渐调节pH至
中性后，可发生重新折叠，即pH偏移。

pH偏移可使蛋白质处于变性与未变性之间的熔球态，通常保留变性前大部分二级结构，但三级结构发生较大变化，正逐渐成为食品蛋白质修饰的一种方法。

LIU[5]等研究表明，pH偏移结合温和热处理，
可使大豆分离蛋白质的胶凝性、表面疏水性和颗粒大小增加，巯基向二硫键转化并形成聚集体且溶解性降低，内源性荧光表明大豆分离蛋白空间结构解体，圆二色谱表明二级结构遭到轻微破坏，该技术有助于改进大豆分离蛋白的功能特性。

NIU[6]等研究了天然大豆分离蛋白和pH偏移结合温和热处理后的大豆分离蛋白，以及肌原纤维蛋白热稳定性和成胶性的影响。

结果表明，处理后的大豆分离蛋白，可增加肌原纤维蛋白凝胶压力和减少水分损失，处理后大豆分离蛋白可增加氢键和二硫键，原子力显微分析表明，处理后大豆分离蛋白可降低肌原纤维蛋白凝胶的粗糙性、凝胶性和持水力等。

国内有关食品蛋白的研究，主要集中在提取、理化性质、酶解工艺、抗氧化组分及
活性肽制备等方面[7-11]，国外则集中在溶解性、乳化性、流变学、胶凝、表面形态、构象和质构等方面[12-17]，有关pH偏移结合温和热处理蚕豆蛋白的研究未
见报道。

本实验以pH1.5偏移结合25、37和55 ℃温和热处理不同时间后，逐渐恢复至中性，研究蚕豆分离蛋白(broad bean protein isolate，BBPI)溶解性、乳化性、巯基/总巯基含量、紫外和荧光光谱、表面疏水性、二级结构含量和微结构
的变化，为BBPI在食品行业的进一步应用提供理论依据。

1 试剂与方法
1.1 材料与仪器
蚕豆蛋白：江苏盐城朱港村五谷行。

8-苯胺基-1-萘磺酸钠(ANS)：东京化成工业
株式会社；Ellman试剂：BBI；牛血清白蛋白：生工生物工程(上海)股份有限公司；考马斯亮蓝G-250、甘氨酸、尿素、硼酸、DTNB、Tris、EDTA、磷酸二氢钠、
磷酸氢二钠和正己烷等均为国产分析纯。

RF-5301PC荧光分光光度计、UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津；722可见分光光度计，上海欣茂有限公司；PHS-3D雷磁pH计，上海精密科学有限公司；TGL-20M型高速台式冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；AL-204型电子天平，梅特勒-托利多有限公司；90-3型定时恒温双向磁力搅拌器，上海亚荣生化仪器厂；KDF-103F自动定氮仪，上海纤检仪器有限公司； JSM-6701F冷场发射扫描电子显微镜，日本电子；Nicolet-iS5傅立叶变换红外光谱仪，美国Thermo fisher。

1.2 方法
1.2.1 BBPI制备
参照曾茂茂的方法[18]，稍作修改。

取50 g蚕豆粉，按料液比1∶3(g∶mL)加入
正己烷，脱脂2次，5 000 r/min离心15 min，沉淀分散于1 250 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中，调pH 7.5～8.0，40 ℃水浴搅拌3 h，5 000 r/min离心15 min，
上清液调pH4.5酸沉，静置过夜。

8 000 r/min离心15 min，水洗1～2次，沉
淀干燥备用。

经凯氏定氮法测定，BBPI蛋白含量为(77.65±0.23)%。

1.2.2 溶解性
0.1 mg/mL牛血清白蛋白0.0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL，分别加入0.1
mg/mL考马斯亮蓝3.0 mL，混匀595 nm测光吸收值。

以牛血清白蛋白质量为
横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

标准曲线方程为Y=10.249X+0.018 3，R2=0.992 5，X为蛋白质量，mg，Y为光吸收值。

利用0.01 mol/L pH 7.0
磷酸缓冲液配置5%BBPI，调pH至1.5后，分别在25、37和55 ℃条件下水浴。

0、1.5、3.5和5.5 h时，取10～15 mL调pH7.0，混匀静止1 h。

搅拌分散30 min后，5 000 r/min离心15 min，稀释后取0.5 mL上清液测光吸收值[19]。

总蛋白含量采用凯氏定氮法测定。

溶解度
(1)
1.2.3 乳化性
利用0.05 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液配置2%BBPI，其余同1.2.2。

9.0 mL
2%BBPI与3.0 mL菜籽油混合，均质3 min，立刻在底部吸取60 μL乳化液加至15 mL 0.1%SDS中，振荡混匀后在500 nm测定光吸收值，根据公式(2)计算乳
化活力指数(EAI)，10 min后测定光吸收值，根据公式(3)计算乳化稳定性(ESI)[20]。

(2)
(3)
式中:n,稀释倍数,250；ρ,蛋白质质量浓度,g/mL；ω,乳化液中油相体积分数(1/4)；A0,0 min时吸光值；A10,10 min时吸光值；L,比色皿厚度，1 cm。

1.2.4 活性巯基测定
参照卢岩的方法[21]，稍作修改。

利用0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液配置
2%BBPI，其余同1.2.2。

1.0 mL 2%BBPI加入pH 8.0 Tris-甘氨酸溶液8.0 mL，均质后10 000 r/min离心15 min。

4.5 mL上清液和0.5 mL 10 mmol/L Ellman(pH 8.0 Tris-Gly溶解)试剂反应，空白含4.5 mL Tris-Gly和0.5 mL 10 mmol/L Ellman试剂，30 min后在412和540 nm测定光吸收值。

活性巯基含量/(μmoL·g-1)= 73.53×(A412-1.693 4A540
+0.009 932)
(4)
1.2.5 总巯基测定
参照李学鹏的方法[22]，稍作修改。

利用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液配置
2%BBPI，其余同1.2.2。

1.0 mL 2%BBPI加入8.0 mL Tris-Gly溶液(含8.0 moL/L尿素)，均质后10 000 r/min离心15 min。

4.5 mL上清液和0.5 mL 10 mmol/L Ellman试剂反应，空白为4.5 mL Tris-Gly+0.5 mL Ellman试剂，30 min后412 nm测定光吸收值。

巯基摩尔消光系数13 600 L/(mol·cm)，总蛋白含量(c)测定采用凯氏定氮法。

(5)
式中:A,除去试剂空白后样品的吸光值；D,稀释倍数，9；ρ,蛋白质质量浓
度,mg/mL。

1.2.6 紫外和荧光光谱
利用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液配置2.0 mg/mL BBPI，其余同1.2.2。

以0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液为空白，在270～320 nm范围内进行紫外扫描，制作二阶导数谱。

利用0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液配置2.0 mg/mL BBPI，其
余同1.2.2。

在激发波长281 nm条件下，扫描250～450 nm范围发射光谱，以
波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。

1.2.7 表面疏水性
参照KATO[23]法，稍作修改。

利用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液配置2%BBPI，其余同1.2.2。

0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL上清液，用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液补至4.0 mL，加入50 μL 8.0 mmol/L ANS(0.01 mol/L pH7.0磷酸
盐缓冲液溶解)，混匀静置5 min。

在激发波长349 nm，发射波长490 nm，夹
缝均为5 nm条件下，测定荧光强度。

以荧光强度对BBPI浓度作图，初始段斜率为表面疏水性指数。

以时间为横坐标，表面疏水性指数为纵坐标作图。

1.2.8 电镜扫描
利用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液配置5%BBPI，调pH1.5后分别在25、37和55 ℃下水浴1.5 h后调pH 7.0，混匀8 000 r/min离心5 min，取上清液。

涂片，待干后喷金扫描。

1.2.9 红外光谱分析和谱图处理
1.2.8中处理的BBPI上清液进行真空冷冻干燥。

1 mg BBPI与200 mg KBr均匀
混合，压片，扫描次数64次，分辨率4 cm-1，增益为1。

对光谱进行水汽和二
氧化碳校正，扫描范围400～4 000 cm-1，采用DTGS检测器进行红外光谱测定。

采用Omnic 8.2软件在酰胺I带范围内(1 700～1 600 cm-1)进行基线校正、去卷积和二阶求导处理，并利用Peakfit 4.12软件对二阶导数曲线拟合至R2≥0.99，
根据峰面积计算BBPI二级结构的百分含量。

1.2.10 数据统计
采用SPSS 16.0进行显著性分析(P<0.05)，采用Origin 7.5作图。

2 结果与分析
2.1 溶解性
pH偏移结合温和热处理对BBPI溶解性的影响见图1。

蛋白质溶解性取决于疏水
作用力、氢键和静电力等分子间作用力，以及pH、盐种类和离子强度等外在因素。

pH 1.5结合25、37和55 ℃分别处理0、1.5、3.5和5.5 h后，其时间-溶解度
曲线均呈V型曲线。

在0～1.5 h范围内时，各组溶解性均出现下降趋势，在
1.5～5.5 h范围内时，37和55 ℃处理组溶解性明显增加(P<0.05)，这是因为pH 1.5处理首先使BBPI彻底变性，疏水基团外露，分子间疏水作用迅速增强而成为
主要因素，因而溶解性下降。

由于BBPI等电点为4～4.2[24]，继续延长处理时间，大部分BBPI带正电荷，分子间斥力逐渐成为主要因素，使BBPI与水分子间作用
力增强，因此溶解性增加。

与pH 7.0,25 ℃相比，各组溶解性均明显增加，且pH 1.5，55 ℃处理组溶解性最高，这是因为适度增温有利于加大分子扩散而防止聚集，但相应25和37 ℃处理组并未随时间增加呈现明显对应关系。

图1 pH偏移结合温热处理对BBPI溶解性的影响Fig.1 Effects of pH-shifting and mild heating on solubility of BBPI
2.2 乳化性和乳化稳定性
pH偏移结合温和热处理对BBPI乳化性和乳化稳定性的影响见图2和图3。

图2 pH偏移结合温热处理对BBPI乳化性的影响Fig.2 Effects of pH-shifting and mild heating on the emulsibility of BBPI
图3 pH偏移结合温热处理对BBPI乳化稳定性的影响Fig.3 Effects of pH-shifting and mild heating on the emulsion stability of BBPI
当处理时间为0～3.5 h时，各组乳化性开始下降，3.5～5.5 h又逐渐增加。

原因
可能是经过酸处理后，BBPI形成了类似于“熔球态”结构，即其二级结构相对稳
定，但其三级结构发生一定程度变化，且该变化先降低了乳化性，随后由于更多疏水氨基酸的暴露，表面活性开始逐渐增强[25]。

与pH 7.0，25 ℃相比，各组乳化性几乎均出现下降，但与温度具有明显的正相关性。

与pH 7.0，25 ℃相比，各组乳化稳定性均出现下降，这说明虽然pH 1.5处理可诱导BBPI空间结构逐渐展开，疏水多肽链变得更加松散，但当调节至pH 7.0时，部分展开的BBPI重新相互作用，使乳化稳定性降低[25]。

pH 1.5，55 ℃处理组乳化性出现波动，原因可能是
其1.5 h后少量BBPI发生聚合作用，随时间延长，界面分子柔性增加又使得乳化
稳定性逐渐增强。

2.3 活性巯基和总巯基
pH偏移结合温和热处理对BBPI活性巯基和总巯基含量的影响见图4和图5。

对
巯基而言，在0～1.5 h范围内，各组巯基含量逐渐增加，此时BBPI内部巯基暴
露速度快于新二硫键生成速度。

在1.5～5.5 h范围内时，各组变化无明显规律：pH 1.5，25 ℃处理组的巯基含量增加不明显(P>0.05)，这可能是分子内巯基和二硫键交换比较频繁所致，pH 1.5,37 ℃组继续增至最大值，3.5 h后开始下降，pH 1.5,55 ℃组则1.5 h后迅速下降(P<0.05)，这说明适度增温(37和55 ℃)均易加速巯基氧化或巯基与二硫键交换，从而使巯基含量出现下降趋势[26]。

图4 pH偏移结合温热处理对BBPI巯基含量的影响Fig.4 Effects of pH-shifting and mild heating on sulfhydyyl content of BBPI
图5 pH偏移结合温热处理对BBPI总巯基含量的影响Fig.5 Effects of pH-shifting and mild heating on total sulfhydryl content of BBPI
对总巯基而言，其含量约为巯基含量10倍以上，原因是长时间极端酸性条件处理，BBPI结构充分展开使内部巯基暴露，也可能是BBPI亚基解离，二硫键断裂生成
巯基所致，这与HWANG报道一致[27]。

在0～3.5 h范围内，pH 1.5,25 ℃和
pH 1.5,55 ℃处理组的总巯基含量变化不明显(P>0.05)，随时间延长，总巯基含量开始下降。

而pH 1.5,37 ℃组则在0～1.5 h范围内，总巯基含量先增加，随后明
显下降，这说明25和55 ℃处理一定时间后，巯基和二硫键相互转化几乎处于平衡，而37 ℃处理则首先表现为二硫键的氧化程度超过巯基还原，随时间延长，巯基还原程度又逐渐超越二硫键的氧化，因此总巯基含量下降。

2.4 紫外二阶导数光谱
由于Phe、Tyr和Trp在280 nm处均有较强吸收，导致峰信号重叠而难以辨认，因此可利用紫外二阶导数光谱描述其对应的结构变化[28]。

pH 1.5偏移结合温和
热处理对BBPI紫外二阶导数光谱的影响见图6(25 ℃)、图7(37 ℃)和图8(55 ℃)。

在280～300 nm范围内，未处理组BBPI出现两个正吸收峰(289 nm和295 nm)和两个负吸收峰(285 nm和291 nm)。

295 nm处正吸收峰是色氨酸的贡献[29]。

当pH 1.5偏移结合25 ℃处理不同时间后，BBPI在295 nm处发生1～2 nm红移。

随时间延长，峰谷与峰顶距离比(r=a/b)先增加后减小，这表明，pH1.5偏移
结合温和热处理后，BBPI三级结构发生一定程度包裹，原来暴露在分子表面的
Trp残基重新包裹于BBPI疏水核心[30]。

当pH 1.5,37 ℃处理不同时间后，BBPI 在295 nm处发生1～2 nm蓝移，且峰谷与峰顶距离比增加，表明部分已暴露的Trp残基开始发生解折叠而暴露于分子表面。

pH 1.5+55 ℃处理不同时间后，BBPI在295 nm处未发生明显移动，峰谷与峰顶距离比未有明显规律。

图6 pH偏移结合温热处理对BBPI紫外二阶导数光谱的影响Fig.6 Effects of pH-shifting and mild heating processes on UV second derivative spectra of BBPI
图7 pH偏移结合温热处理对BBPI紫外二阶导数光谱的影响Fig.7 Effects of pH-shifting and mild heating processes on UV second derivative spectra of BBPI
图8 pH偏移结合温热处理对BBPI紫外二阶导数光谱的影响Fig.8 Effects of pH-shifting and mild heating processes on UV second derivative spectra of BBPI
2.5 荧光光谱
pH偏移结合温和热处理对BBPI荧光光谱的影响见图9(25 ℃)、图10(37 ℃)和图11(55 ℃)。

各组内源性荧光强度均低于未处理组，这充分说明pH1.5偏移结合温和热处理不同时间后，均可使BBPI分子表面Trp等残基进一步包裹在分子内部疏水核心，即BBPI倾向于重折叠。

对pH 1.5,25 ℃组，随时间延长，荧光强度先降低后增强，且发生一定程度红移，这可能是由于BBPI或其亚基在强酸性条件下，部分Trp疏水侧链首先发生暂时聚集，包裹在BBPI分子内部非极性环境中，从而导致荧光强度下降。

随时间延长，其又逐渐暴露在分子表面极性环境中，但仍处于不稳定状态。

这说明pH 1.5偏移结合25 ℃低温处理时，在0～5.5 h范围内，BBPI色氨酸侧链的聚集或暴露仍未达到平衡。

对pH 1.5,37 ℃组，荧光强度先逐渐增加后又明显降低，且均低于未处理组；对pH 1.5,55 ℃处理组，在0～1.5 h 范围内，荧光强度显著降低，随后继续增加处理时间，荧光强度降至恒值，这说明pH 1.5偏移处理时，适当提高温度可使BBPI彻底聚集，处理时间不影响荧光强度。

图9 pH偏移结合温热处理对BBPI荧光光谱的影响Fig.9 Effects of pH-shifting and mild heating processes on fluorescence spectra of BBPI
图10 pH偏移结合温热处理对BBPI荧光光谱的影响Fig.10 Effects of pH-shifting and mild heating processes on fluorescence spectra of BBPI
图11 pH偏移结合温热处理对BBPI荧光光谱的影响 Fig.11 Effects of pH-shifting and mild heating processes on fluorescence spectra of BBPI
2.6 表面疏水性
pH偏移结合温和热处理对BBPI表面疏水性的影响见图12。

表面疏水性反映蛋白质三级结构中表面疏水基团的分布情况，可影响溶解度、吸水性、乳化性和凝胶性等其他功能性质。

ANS是一种带负电荷的阴离子探针，在pH 1.5酸性条件下，不仅和蛋白质表面带正电荷氨基酸残基通过静电相互作用而结合，且可蛋白质表面暴露的疏水区域相结合，因此表面疏水性指数不仅反映的是BBPI表面疏水性，同时也反映了ANS与BBPI分子间的静电引力[31]。

温度是影响BBPI结构的重要因素，长时间50 ℃以上处理，BBPI分子结构可发生重排，但不同的蛋白质，可能呈现
不同规律[32]。

总体分析，pH 1.5偏移处理下，BBPI表面疏水性变化较为复杂，表明为其稳定性较差[33]。

在0～1.5 h范围内，各组表面疏水性均急剧增加，随
时间延长，除pH 1.5,55 ℃组外，其余两组均显著降低，原因可能是当pH 1.5偏移处理后，包裹在蛋白质分子内部的疏水侧链暴露在分子表面，蛋白质疏水性增强，但随时间延长，蛋白质并非只有一种结构模式，BBPI展开后再聚集，依赖于疏水
侧链间相互作用而包埋在分子内部[34-35]，从而降低了表面疏水性。

在3.5～5.5 h范围内，pH 1.5,55 ℃组表面疏水性反而增加，原因可能是BBPI分子中α螺旋含量较小，约为15%[36]，而有证据表明α螺旋含量可能与温度对表面疏水性指
数的影响有关[32]。

当温度超过50 ℃时且经过3.5 h长时间处理后，β折叠作为
分子间有序排列被不同程度破坏，α螺旋作为分子内有序排列而增强[37]，因而表
面疏水性增加。

表面疏水性与溶解性几乎呈负相关性，这主要是溶解性取决于BBPI分子亲水性和疏水性的平衡，该平衡又取决于氨基酸组成，特别是分子表面
氨基酸组成[34]。

NAKAI[38]等研究认为，表面疏水性与乳化性成正相关，本研究结果与其一致。

图12 pH偏移结合温热处理对BBPI表面疏水性指数的影响Fig.12 Effects of
pH-shifting and mild heating on surface hydrophobicity index of BBPI
2.7 二级结构含量测定
不同pH和温和热处理对BBPI二级结构含量的影响见表1。

一般情况下，1 600～1 639 cm-1和1 689～1 699 cm-1谱带归属于β-折叠，1 640～1 650
cm-1谱带归属于无规则卷曲，1 651～1 660 cm-1谱带归属于α-螺旋，1 661～1 688 cm-1谱带归属于β-转角[39]。

由表1可知，BBPI各二级结构含量依次为：对pH 7.0,25 ℃处理组，β-折叠34.79%，α-螺旋50.63%，β-转角14.59%；对pH 1.5,25 ℃处理组，β-折叠53.07%，无规则卷曲8.28%，α-螺旋6.28%，β-
转角32.37%；对pH 1.5,37 ℃处理组，β-折叠53.07%，无规则卷曲8.28%，α-螺旋6.29%，β-转角32.36%；对pH 1.5,55 ℃处理组，无规则卷曲58.06%，β-转角41.94%。

由上述分析可知，在25～37 ℃范围内，pH 1.5偏移处理可使α-
螺旋向β-折叠、β-转角和无规则卷曲转化，当增至55 ℃时，α-螺旋和β-折叠全
部转化为β-转角和无规则卷曲。

α-螺旋和β-折叠为BBPI的有序结构，β-转角和
无规则卷曲为无序结构，随温度不断增加，BBPI的α-螺旋和β-折叠百分含量之
和呈明显降低趋势，这表明BBPI稳定性逐渐降低。

表1 不同pH和温和热处理对BBPI二级结构含量的影响Table 1 Effects of different pH and mild heating processes on secondary structures of BBPI处理组峰归属峰位/cm-1峰面积/%pH 7.0,25 ℃β-折叠1 6121.28β-折叠1
6214.95β-折叠1 63524.91α-螺旋1 6510.38α-螺旋1 6540.23α-螺旋1 65750.02β-转角1 67814.59β-折叠1 6903.65pH 1.5,25 ℃β-折叠1 6101.93β-折叠1 6210.98β-折叠1 6304.10无规则卷曲1 6425.78无规则卷曲1
6492.50α-螺旋1 6586.28β-转角1 66614.06β-转角1 6736.88β-转角1 67911.43β-折叠1 69132.86β-折叠1 69913.20pH 1.5,37 ℃β-折叠1
6101.93β-折叠1 6210.98β-折叠1 6304.10无规则卷曲1 6425.78无规则卷曲1 6492.50α-螺旋1 6586.29β-转角1 66614.04β-转角1 6736.90β-转角1 67911.42β-折叠1 69132.86β-折叠1 69913.20pH 1.5,55 ℃无规则卷曲1 64158.06β-转角1 67141.94
2.8 电镜扫描
图13～图16分别为BBPI在pH 7.0,25 ℃、pH 1.5,25 ℃，pH 1.5,37 ℃和pH 1.5,55 ℃条件下，处理1.5 h时扫描电镜下的形貌。

由图13～图16可知，不同
温度处理下，BBPI均形成大小不均匀的球状体，粒径约为80～130 nm。

各球状
体存在团聚现象，形成“沟壑”，如A、B、C区域所示，随温度增大，团聚现象
降低，可能与溶解性增强有关，但球体粒径较为接近。

与pH 7.0,25 ℃处理组比较，pH 1.5,25 ℃形貌变化不大，可能是1.5 h处理时间较长，不同程度抵消了
pH 1.5处理对BBPI形貌等的影响。

图13 pH 7.0,25 ℃条件下BBPI形貌Fig.13 Morphology of BBPI at pH 7.0,25 ℃图14 pH 1.5,25 ℃条件下BBPI形貌Fig.14 Morphology of BBPI at pH 1.5,25 ℃图15 pH 7.0,37 ℃条件下BBPI形貌Fig.15 Morphology of BBPI at pH 7.0,37 ℃
图16 pH 7.0,55 ℃条件下BBPI形貌Fig.16 Morpholo gy of BBPI at pH 7.0,55 ℃3 结论
(1)随时间延长，BBPI溶解性和乳化性均先降低后增加，但与pH 7.0,25 ℃处理组相比，各组溶解性均增加，乳化性几乎均下降。

乳化性随温度的升高而增强，但溶解性并不完全与温度成正比。

随时间延长，乳化稳定性无明显规律，但均随温度增加而逐渐增强，37和55 ℃处理组巯基含量先增加后降低，25 ℃处理组则变化不大，37 ℃处理组总巯基含量先增加后迅速下降，25和55 ℃先平稳后降低。

(2)紫外和荧光光谱表明，随时间延长，25 ℃处理组的大部分色氨酸残基包裹在分子内部疏水微环境，发生1～2 nm红移动，37 ℃处理组表现为色氨酸残基开始部分性解折叠，色氨酸残基又逐渐暴露在分子表面，发生1～2 nm蓝移，55 ℃处理组则未有明显变化。

(3)结果表明，BBPI的表面疏水性与溶解性呈负相关，与乳化性成正相关。

25和
37 ℃处理时，BBPI的表面疏水性先增加后降低，55 ℃处理则先增加后出现一定
波动。

(4)随温度升高，BBPI二级结构中的α-螺旋和β-折叠逐渐转化为β-转角和无规则卷曲。

随温度升高，BBPI电镜扫描均形成粒径约为80～130 nm的球状体，且存在团聚和“沟壑”现象，但团聚现象逐渐降低。

(5)由于未变性或完全变性的蛋白具有相对较强的热稳定性，功能特性并不十分理想，而通过pH偏移结合温和热处理改性处理，BBPI构象发生一定程度变化而形
成熔球态，则有望进一步改善其起泡性、溶解性、乳化性、成胶性和成膜性等功能性质，这将有助于进一步提高BBPI的应用价值和拓展其应用范围。

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