生物进化上杂交捕获法

生物进化上杂交捕获法
1.为什么进行杂交捕获？
在文库构建完成后，若是做全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS），可直接将构建好的文库按照一定的浓度、测序深度、数据量进行上机测序即可。

但在实际的操作中，由于人的基因组中存在大量丰富的重复DNA序列，且考虑到测序成本的问题，所以通常会进行靶向测序，即选择我们需要的区域进行测序，比如全外显子测序（Whole-exome sequencing，WES），或者针对肿瘤患者设计的特定的Panel测序等（一个Panel指包含所有探针的一个集合，eg：一个Panel里包含200个探针，200个探针的集合就是一个Panel）。

那么如何获得所需的目标区域或者靶序列呢？就需要探针与靶序列
进行杂交，然后再通过捕获杂交片段的方法进行目标区域的富集。

2. 实验流程&作用
2.1 杂交准备
杂交需要投入的原料：
①一定量的文库：可以是一个文库或者多个文库，多个文库的话可根据不同的接头序列区分每个样本；
②Human Cot DNA：封闭大量重复的DNA序列，避免非特异性杂交；
③Universal Blockers：封闭接头序列，避免非特异性杂交；
④不同的Panel：生物素标记的探针，主要负责与靶序列杂交；
⑤杂交Buffer、杂交Enhancer、NF水等；
注：杂交原料进行杂交时，由于杂交体积限制，都会进行体积浓缩，常用到的是采用真空浓缩的方法；此外还有磁珠法浓缩；针对不同的浓缩方法，各种杂交原料的加入顺序有一定的差异。

真空浓缩法：①+②+③→真空浓缩→+④+⑤→杂交。

磁珠浓缩法：①+②+④→磁珠浓缩→+③+⑤→杂交。

真空浓缩法在小Panel杂交的过程中表现比磁珠浓缩法较好，但磁珠浓缩法更简便快捷，成本更低。

2.2 杂交
95℃将文库变性为单链状态；
65℃进行杂交；
注：A&C：表示探针与靶序列杂交；B&D表示未杂交。