黑水缬草化学成分和生物活性研究

黑龙江中医药大学
硕士学位论文
黑水缬草化学成分和生物活性研究
姓名:张忠立
申请学位级别:硕士
专业:中药学
指导教师:匡海学
20070501黑龙江中医药大学硕士学位论文
缩略语
缩略语英文全称中文译名核磁共振谱廿,Ⅱ一维核磁共振谱.
二维核磁共振谱
书琢很
℃
曲幽娜∞
胁, 高效液相色谱无畸变极化转移增强法
核磁共振谱相关谱
检测氢核的异核单量子相
豳西瑚姗
关谱核磁共振谱检测氢核的异核多键相关
∞谱核磁共振谱
质谱
电喷雾离子化质谱快原子轰击质谱
.. 柱色谱
十八烷基键合相硅烷
薄层色谱
四甲基硅烷
紫外可见吸收光谱
缸黑龙江中医药大学硕士学位论文
缩略语
原创性声明
本人郑重声明:所呈交硕士学位论文,是本人在指导教师的
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日期: 年月日
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论文作者签名: 指导教师签名:
日期::年舌
日期: 年月日
黑龙江中医药大学硕士学位论文
摘要
黑水缬草为败酱科缬草属.植物黑水缬草
. .的干燥根及根茎。

黑水缬草主要分布于我国的东北三省、俄罗
斯远东地区和朝鲜北部。

黑龙江省大兴安岭地区蕴藏着丰富的黑水缬草资源,
关于其化学成分及生物活性方面的研究报道较少。

缬草属在神经系统、心脑血
管及抗肿瘤等方面有不同的药理作用。

本文研究黑水缬草根及根茎在抗中枢神
经系统退行性病变老年痴呆中的作用,确定了黑水缬草根及根茎在抗老年痴呆
中的有效部位为%树脂洗脱组分。

为了进一步阐明黑水缬草抗老年痴呆的药效物质基础和作用机理,我们对
黑水缬草根及根茎的有效部位进行了系统的提取分离和化学结构鉴定研究。

通
过硅胶柱色谱、柱色谱、等分离方法,采用、”砌、
、和等、波谱学测试手段,结合.
质谱,分离并鉴定了个化合物的结构,均为木脂素类化合物。

个木脂素类
化合物均在该植物中首次发现。

最后,为探求一种更合理、更有效的研究中药及复方作用于中枢神经系统的药效物质基础和作用机理的研究方法,本实验采用。

中药脑脊液药理学”的
方法,应用含药物成分的脑脊液进行细胞药理研究。

为了使试验条件更接近于
药物在体内产生效应的内环境,除了在体外增加十倍给药剂量而获得的脑脊液
外,还采用冻干脑脊液做体外细胞的药效学研究。

将黑水缬草根及根茎
的有效部位给药后的脑脊液及其冻干脑脊液进行了体外确证试验。

结果表明有
效部位给药后的脑脊液及其冻干脑脊液对.诱导损伤的神经细胞具有增
强细胞活力,抑制细胞凋亡的作用,.从而进一步确定了黑水缬草抗老年痴呆的
药效物质基础。

以上的这些研究为研制开发治疗老年痴呆的薪型现代中药提供
科学依据和奠定了基础。

关键词;黑水缬草:老年痴呆;化学成分;脑脊液药理学黑龙江中医药大学硕士学位论文.....
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人口老龄化是当今世界各国都面临的严重问题。

年第五次全国人口普
查结果表明:北京岁及以上老年人口占总人口比例己经接近%,远高于
全国%的平均水平。

老年性痴呆是老龄化社会的必然问题,已跃
居为继心脑血管、肿瘤之后的第三位致死疾病,因此成为世界性的热点研究领
域。

据统计,全世界已有病人万,美国超过万人患此病;我国
年统计,岁及以上老年人口达.亿,如按%发病率计算,将有
万人左右。

我国对老年痴呆研究起步较晚,而我国又是在经济欠发达时就己出
现人口老年化。

因此,给社会和家庭带来的压力和经济负担己经高于欧美
发达国家,且这类疾病极大地影响老年人生活质量的提高,同时也会间接影响
国民经济发展和社会稳定。

因此,老年性痴呆的防治己成为十分紧迫的社会和
医学问题。

缬草,英文名,来源于拉丁语”,是“勇气”或者“健康”的意
思。

十八世纪中期,缬革制剂在北欧第一次作为镇静剂使用。

进入十九世纪, 人们开始对缬草进行化学成分分析,其中挥发油被作为重要部分进行研究,之
后人们相继发现了总缬草素类成分及缬草烯酸类成分.缬草制剂在欧美植物药
市场具有举足轻重的地位,已被美、德、英、意、日等国药典收载。

据统计, 败酱科缬草属 .植物,全世界约有余种,我国约有种含
变种,.主要分布于西南及东北地区。

黑水缬草.麟.主要分布于我国东北三省,
在大兴安岭地区资源丰富。

其同属植物早已被用来治疗失眠等多种疾病,而且
在神经系统、心脑血管及抗肿瘤等方面也有不同的药理作用,最新研究发现缬
草属中化学成分对神经退行性疾病老年痴呆有治疗作用。

但至今未见黑水缬草
药用研究的报道。

为了开发新的药用资源,本实验课题组对黑水缬草进行了全面系统的研
究,针对黑水缬草的有效部位,进行了系统的化学成分分离,并结合药理学从整体、组织、细胞水平多层次、多途径、多靶点来研究黑水缬草抗老年痴呆和
镇静催眠方面的作用,为寻找一种新的治疗中枢神经系统方面疾病的中药材并
进而研制开发出创新药物提供科学依据和奠定了基础。

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第章文献综述
,
.缬草属植物的研究
缬草,英文名,来源于拉丁语“”,是“勇气”或者。

健康”
的意剧¨。

十八世纪中期,缬草制剂在北欧第一次作为镇静剂使用。

进入十九
世纪,人们开始对缬草进行化学成分分析,其中挥发油被作为重要部分进行研
究,之后人们相继发现了总缬草素类成分及缬草烯酸类成分。

在过去的一百多
年时间里,许多化合物被分离并确定结构,但仍无法明确缬草中究竟是哪类成
分发挥镇静作用。

目前,被人们所广泛认可的是,缬草镇静安神作用是由挥发油、缬草素、缬草烯酸等几大类成分共同发挥作用来实现的。

据统计,败酱科缬草属 .植物,全世界约余种,主要分
布于气候温和潮湿的地区,遍布整个欧洲、亚洲北部、美国以及南美洲,其中,我国约有种含变种,主要分布于西南及东北地区【。

据不完全统计,
全世界有个国家的多种缬草得到了不同程度的研究,其中 .
已被德国、法国、英国、荷兰、意大利、日本等国药典收载,年中国药典曾收载马蹄香。

目前缬草药用的主要商品来源是缬草
同义名
.,印度缬草和墨西哥缬
草 .
.。

..缬草属类化学成分的研究
迄今为止从缬草属的药用植物中分离出多种化学成分。

该属植物的化学成分主要是单萜类、倍半萜类、木脂素类、生物碱类、黄酮类等。

...挥发油类化学成分
缬草中含挥发油类成分多种多样,且随着气候及生态环境的不同而有所不同。

缬草属植物一般含挥发油.%.%,少数高达%一%,个别只有.%。

挥发油中已报道的化合物超过种,其中主要成分为单萜及倍半萜类,共有
成分为洳蒎烯、樟脑、龙脑、泓松油醇
、
、莰烯、蒎烯、乙酸龙脑酯
桧烯、柠檬烯等。

与国内缬草属植物相比,国外缬草
、、
中还含有小葑烯旺.、、
、等成分【司。

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...环烯醚萜类化学成分
从缬草中己分得种环烯醚萜类化合物,其中种苷元,种苷。

缬草
中环烯醚萜又可分为单烯闭环、单烯开环、双烯闭环、双烯开环四类。

单烯型
环烯醚萜化合物有:,,,.
等。

双烯型环烯醚萜有:,,,.
,,,等。

其中
和被认为是缬草三酯因酶解或完全分解而产生的降解产物【】。

...倍半萜类化学成分
从缬草挥发油或根部提取物中分得约种倍半萜类化合物,绝大多数为
倍半萜苷元,只得到种倍半萜苷。

其倍半萜苷元除少量为单环甜没药烷型倍半萜外,其余为双环倍半萜类。

六元环稠合的双环倍半萜可分为缬草烷型倍半
萜和佛木烷型倍萜两种类型,分离得到的缬草烷型倍半萜有:缬草酮
,缬草醛。

分离得到的佛木烷型倍半萜有。

五元、六元环稠合的双环倍半萜类化合物主要有:缬草烯酸,乙
酰氧基缬草烯酸。

五元、七元环稠合的双环倍半萜类化合物以愈创木烷型居多,
等。

单环甜没药烷型倍半萜则有
如, ,。

...生物碱类化学成分
从缬草中分离得到种生物碱,主要是单萜生物碱.。

单萜生物碱包括吡啶生物
与阿卟菲型生物碱
碱和季胺型生物碱两种。

吡啶生物碱主要有猕猴桃碱、缬草碱
和缬草宁碱。

季胺型生物碱如:.阿卟菲型生
物碱数量较多,结构复杂,但生源关系十分明确,如,
,,,,,
,缬草宁碱等生物碱。

...黄酮类化学成分
从缬草中分离得到约余种黄酮,它们大多来源于缬草的地上部分花与
叶。

缬草中含有槲皮素、芹菜素、莰菲醇、
金合欢素腾黄菌素等黄酮类成分等~。

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..缬草属植物的药理学研究
...在神经系统的药理作用
镇静催眠作用:缬草提取物在临床上用于镇静、催眠、抗惊厥,其中以镇
静安神治疗作用为主,在欧美植物药市场具有举足轻重的地位。

到目前为止, 研究发现缬草属植物的镇静安神作用是由几类成分共同发挥作用来实现的,包
括挥发油中的愈创木烷型倍半萜和缬草烷型倍半萜,以及缬草根中的环烯醚萜
类成分和缬草烯酸类成分网。

同时研究表明缬草醇提物具有明显镇静催眠作用。

当神经受到样淀粉蛋白,所致的毒性作用,缬草提取物可以保
护神经,原因可能是缬草提取物可以降低神经网络的兴奋性。

将小鼠的神经元
暴露在.达到~,然后评价其形态学和生化性质,缬草提取物可
以防止神经元容量的减少和相关神经的退化【。

...对循环系统的药理作用
心血管的药理作用:国内学者研究发现向小鼠腹腔分别注射缬草挥发油、环烯醚萜类成分、缬草%乙醇提取物后,可明显增加小鼠心肌细胞对
的摄取量,说明有增加心肌营养血流的作用。

杨桂元掣协使用宽叶缬草提取物治疗冠心病,结果表明有改善心绞痛症状,减轻心绞痛发病频率,缩短心绞痛发作持续时间。

还具有抗心率失常、增加冠脉流量、改善心肌组织的微循环
灌注、缩小心肌梗死范围、对心肌细胞缺氧/在给氧损害具有良好的保护作用。

脑血管的药理作用:神农缬草提取物中挥发油具有显著增加脑组织血流灌注的作用;缬草提取物有提高小鼠脑组织微循环灌流的作用,同时对去甲肾上
腺素所致的急性脑缺血也有一定的拮抗作用,能明显改善小鼠脑细胞供血不‘
足,特别是高剂量组作用与川芎嗪相当,且量效关系成正比,提示它有改善脑组织微循环灌流和脑细胞供血不足的效应,其作用机制可能与缬草提取物具有
解除动脉痉挛、增加脑血流量、抑制血小板聚集和改善微循环的功效有关【嘲.
防治血管狭窄的药理作用:血管内膜损伤后血管平滑肌细胞过
度增殖,迁移,分泌是引起血管狭窄的关键性因素之一,宽叶缬草能抑制兔的合成,故有可能成为一种新的预防血管狭窄的药物【。

宽叶缬草对兔蛛网膜下腔出血后基底动脉管径和血流速度的影响:
扩张脑基底动脉可能与保护和修复内皮细胞的结构完整有关。

进一步研究表明能提高的产生,抑制的分泌及肿瘤坏死因子的产生,从
而抑制白细胞、血小板的黏附、聚集,减轻血小板对内皮细胞的损伤。

等认为肿瘤细胞坏死因子的升高是导致血管内皮细胞受损及缩血管活性物质
如内皮素升高的重要因素,阻止肿瘤坏死因子产生和增加其降解,对阻止
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后神经组织和血管中存在的炎症免疫反应.血管痉挛和缺血过程可能有价值。

后氧合血红蛋白能够浸润到血管壁,抑制舒血管活性物质的活性而产生一
系列病理作用,主要是氧自由基对血管壁损伤作用的结果,具有提高
活性,降低的作用,从而具有清除自由基的能力,因此扩张痉挛的
脑基底动脉,可能是通过清除自由基、抗炎、防止血小板及白细胞聚集黏附、抑制免疫反应等作用来减轻血管内皮细胞的损伤【。

同时能扩张脑基底
动脉,改善微循环,保护神经元坏死,其作用与相近【培聊。

其它药理作用:宽叶缬草油具有调节血脂和抗脂质过氧化作用:保护肾
脏的药理作用,陈玲等【】发现缬草油可明显减轻型糖尿病大鼠的肾小球体积
缩小、系膜增生,明显改善型糖尿病大鼠的肾脏损害,减少蛋白尿,延缓肾
功能损害的进展,同时还能增加肾组织微循环灌流量。

...抗肿瘤的药理作用
将印度缬草中提取的缬草素、乙酰缬草素及其代谢产物,分别以
的相同浓度处理体外培养的大鼠肝癌细胞株,发现缬草素的毒性作用
最强,存活率曲线显示其毒性为乙酰缬草素的倍、的倍。

其中,
乙酰缬草素与肝癌细胞反应迅速,量效曲线显示.,后肝癌细胞出现
死亡,后肝癌细胞全部死亡圈。

...抗菌及抗病毒的药理作用
从缬草中提出的总生物碱有抗菌作用,特别是对革兰氏阳性细菌效力较
好。

单体缬草碱和缬草恰碱也具有一定的抗菌作用。

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.黑水缬草的研究
..原植物形态学研究
多年生草本,植株高~。

根状茎短缩,不明显,根多数簇生,有
特异气。

茎直立,不分枝,被租毛。

茎生叶对生, ~~对,羽状全裂;
下部叶较大,长~ ,叶裂片卵形,先端钝,偶锐尖,叶缘
,宽~
具粗牙齿,疏生短毛,叶柄基部扁平:上部叶较小,叶裂片甚狭,锐尖,具牙
齿或全缘,无柄。

聚伞花序顶生,花梗被腺毛和粗毛;小苞片,披针形或线形, 先端渐尖至急尖,具腺毛。

花冠裂,浅粉色或白色,花冠筒漏斗状,长约~
;雄蕊,生于花冠筒基部,顶端超出花冠裂片;子房下位,室,其中
室结实,室败育;瘦果狭三角卵形,长约,被粗毛。

花期~月,果
期~月。

..黑水缬草化学成分研究
...挥发油类化学成分研究
黑水缬草中含有挥发油类成分多种多样,其中主要成分为单萜及倍半萜
类,其成分有甜蒎烯、樟脑、龙脑、松油
醇、莰烯、争蒎烯肛、乙酸龙脑酯
、桧烯、柠檬烯等。

黑水缬草挥发油的主成分
反石竹烯在同属其他缬草植物中广泛存在,但相对含量均未超过.%;黑水缬草挥发油中的第二大成分,烯基.甲基.乙烯基.环己烷,在其他缬草
类植物挥发油成分中未见报道,为缬革属植物中首次发现;黑水缬草挥发油中
的第三大成分乙酸龙脑酯是同属其他植物如中国缬草、蜘蛛香、毛节缬草及窄裂缬草等挥发油中的主成分,含量在%以上,部分甚至达%以上。

...其它类化学成分研究
黑水缬草的根和地上部分均含有环烯醚萜类化合物缬草三酯;地上部分还含有山萘酚、槲皮素、芹菜素苷、芹菜素、
木犀草素、香叶木素和刺槐素等黄酮类化合物;另
外还含有机酸、咖啡酸、绿原酸、对羟基苯甲酸等化
合物】。

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黑水缬草原植物
黑水缬草根及根茎黑龙江中医药大学硕士学位论文
.木脂素类化合物化学结构及生物活性研究
..木脂素类化合物的结构研究
木脂素是一类由苯丙素氧化聚合而成的天然产物,通常所指是
其二聚物,少数是三聚物和四聚物【。

由于组成木脂素的.单元多种类型
肉桂醇、肉桂酸、丙烯基酚和烯丙基酚等及缩合位置不同和由双分子苯丙素缩合成各种碳架后,侧链碳原子上的含氧官能团如羟基、羰基、羧基等相互脱水缩合,再形成半缩醛、内酯、四氢呋喃等环状结构,使得木脂素的结构类型繁多。

常见的类型的基本碳骨架如下:
①二芳基丁烷类②双环辛烷类黑龙江中医药大学硕士学位论文
⑧苯骈二氧六环类
⑦苯骈呋喃类
⑩异木脂素类
⑨联苯环辛烯类
..木脂素类化合物生物活性研究
...抗肿瘤活性
不少木脂素具有细胞毒作用,可以抑制肿瘤细胞的生长。

天然各种鬼臼毒素类木脂素均显示强的细胞毒活性,能显著抑制癌细胞的增殖,但其毒性很大,
难以应用于临床,但半合成的产物如.和已开发成抗癌药物应用
于临床。

近年从翼梗五味子果实中得到的五脂素卜、表五脂素及表五脂素
酮等联苯环辛烯内酯木脂素,经体外抗癌筛选,皆具有不同程度的抑制白血病
活性。

其他类型的木脂素如、和厚朴酚等也具有细
胞毒活性。

...肝保护作用
五味子和华中五味子果实中分离得到的五味子丙素、五味子素、五味子醇乙及五味子酯甲等联苯环辛烯型木脂素多具有保肝作用和降低血清谷丙转氨
酶的作用,如五味子酯甲、五味子丙素及其类似物已在我国成为治疗肝炎的药
物。

化学结构中的亚甲二氧基可能是其重要的活性基团。

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水飞蓟素具有保肝的作用,临床用以治疗急性、慢性肝炎和肝硬化。

芝麻油中也含有多种天然抗氧化保肝成分。

...抗病毒活性
从南五味子中得到的戈米辛、五味子酯等数种木脂素对的增殖具
有显著抑制作用。

从
中分离的木脂素类成分、
及~对乙型肝炎抗原和乙型肝炎表面
抗原均表现出中度至强度的对抗作用。

从新疆紫草中分离得到的咖啡
酸四聚体,具有抑制的活性。

其它如从叶下珠属草药中分离得到的木脂素类
和具有抑制的逆转录酶和聚合酶的
作用。

鬼臼毒素类木脂素对麻疹和单纯疱疹病毒有抑制作用。

...平滑肌解痉作用
五味子果实中的木脂素类成分对和引起的离体狗肠系膜动脉
收缩具有抑制作用,显示钙拮抗活性,其中戈米辛作用最强。

...对心血管系统的作用
海风藤中木脂素对血小板活化因子具有拮抗活性,其中海风藤酮
活性最强。

从异型南五味子分离得到的多种联苯环辛烯类木脂
素也具有拮抗活性。

一些芳基萘的酯和它的杂原子衍生物具有降脂作用, 在大鼠实验中,不但可以降低血清胆固醇水平,而且可以提高高密度脂蛋白的
’
水平。

...抗氧化作用
五味子和华中五味子果实中分离得到的五味子丙素、五味子素、五味子醇乙及五味子酯甲等联苯环辛烯型木脂素多具有抗氧化作用。

其中的某些成分通
过捕获氧自由基而起到抗氧化作用。

另外,亦能增强细胞内抗氧化酶如超氧化
物歧化酶和过氧化氢酶活性以清除氧自由基。

至于为什么五味子酚抗氧化活性
比其他化合物的作用强,很可能与其结构式上的酚羟基有关。

五味子种成分中仅五味子酚的苯环上有一个羟基,其余各化合物的苯环上无羟基而有甲氧基,抗氧化活性最弱的化合物五味子醇甲和五味子醇乙的八圆环上有一羟基。

正是由于羟基位置不同而降低了其抗氧化作用。

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.对老年痴呆的研究
’阿尔茨海默病.∞是一种进行性的神经退行性疾病,老
年人发病率较高。

临床表现主要为记忆力减退、定向障碍和判断推理能力受损等。

病理表现为大脑皮质和海马出现大量的老年斑,和神经
纤维缠结。

淀粉样蛋白是老
年斑的主要成分,也是的病理特征之一。

根据报道,老年痴呆的发病机制
有多种学说: .淀粉样蛋白的沉积学说;.胆碱能损伤学说;.自由基损伤
说;.钙平衡失调学说;.基因突变学说;.内分泌失调学说;.炎性反应学
说;雌激素学说。

本文主要研究雌性激素、氧化应激和炎症反应与的关
系。

其它发病机制由本实验组的其他同学探讨。

..雌激素与
过去人们只注意到雌激素与性行为有关,但现在大量的研究表明,雌激素
有维持和促进大脑一些高级功能的作用。

它不仅刺激胚胎发育中大脑神经细胞
的生长,而且对成年人大脑的识别功能也有增强作用。

流行病学研究表明应用
雌性激素可伴随危险因素的降低,增加认知功能。

同时,雌激素有抗氧化
和抗炎作用刚。

如在老年妇女中明显增加,绝经期妇女的发病率较同
年龄男性高.倍,提示雌激素不足与有某种联系。

绝经后接受雌激
素治疗的妇女比未接受这种治疗的妇女患的机会要小,以上研究说明,雌
激素可能对的进程起保护作用。

雌激素这种保护作用可能与其增加基底前脑水平、增强葡萄糖的运输和代谢、抗氧化能力、减少沉积对细胞
的损伤、减少神经元损害、促进神经元的修复功能等作用有关【¨。

大脑血管
疾患是的一个很重要的原因,雌激素促进和改善识别功能的一个重要
作用就是增加血流量。

雌激索不仅能防止妇女心血管疾患病情的继续恶化,还
能增加血液供应能力。

雌激素有助于胆碱能神经元的生长和存活,能增加基底前脑蚣的水平。

催化神经递质的合成,是一种经典的兴奋性神经递质,其合成、
分泌、代谢及受体功能状况,对学习记忆及认知功能的正常发挥有重要影响。

雌激素可直接保护大脑不受毒素的侵害。

的两个代谢途径是.淀粉
样区域断裂产生可溶性氨基酸片断和.淀粉样区域氨基末端断裂产生具有神经元毒性完整的。

体外培养含雌激素受体的细胞时,生理浓度的雌二醇可
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增加细胞可溶性片段的分泌,而不增加细胞内的水平,从而降低神
经毒性的.淀粉样物质在细胞内的沉积。

在老年人群中,妇女患的机率比男性高,健康妇女在停经后出现较男
性更为严重的海马区和顶叶部的萎缩,并且海马区葡萄糖代谢也明显受损。

雌
激素能增加海马区葡萄糖运输和摄取,增加葡萄糖代谢,从而改善神经元功能。

另外雌激素还有建立和维持突触功能的作用。

中枢神经突触可塑性与学习记忆。