牛奶中微生物的鉴定

牛奶中微生物的鉴定
摘要: 【目的】采用两种种细菌学检查方法对牛乳中细菌进行卫生检查, 比较得出最佳检测方法。

【方法】采用美蓝还原酶实验法、标准平板计数法进行测定, 确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。

【结果】美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法, 操作简便, 不需特别设备.它不能做为定量检查; 平板菌落计数法速度慢,需要平板上长出菌落一段时后才能计数。

【结论】由于平板菌落计数法通常间做梯度稀释,所以计数的线性范围大.由于是菌悬液涂布,所以比较均匀,能较好的反应菌落的疏密程度.重复性,平行性很好,是经典的计数方法。

关键词:生牛乳;细菌
Inspection of Bacteria in the Milk
Abstract: [OBJECTIVE]Knows the bacteriological inspection method in milk and the sanitary quality of the judgment standard , learns to use the pap disinfection method. [METHOD]Uses the methylene blue reductase method,the standard plating count method to carry on the determination.[RESULTS] bacteria；The Methylene blue reductases method is
used in determining the COW'S milk quality．It can not use for the qualitative
examination; The plating colony count methods is relatively slow，needs the growth of bacteria on the plate and colonies can be counted.[CONCLUSION] The plating count method is milk flat bacterial count of the conventional method, this method is sensitive , milk contains a small amount of bacteria, can be calculated the right result.
Key word: The cow' s milk, Bacterium, Inspection
1 材料与方法
1.1试验材料：亚奥特纯牛乳一袋，亚奥特鲜牛乳一袋（已开袋），牛肉膏蛋白胨琼脂；
溶液或试剂：美蓝溶液(1:250000) ；无菌水等；
仪器或其它用具：灭菌培养板（9-12个）、移液枪（一支1ml 一支5ml）、枪头，试管（18*180），棉塞，试管架，水浴锅，电子天平，称量纸，玻璃棒，标记笔，橡皮筋，报纸，酒精灯，火柴，三角瓶（250ml），药匙等。

1.2 试验方法
1.2.1美蓝还原酶实验法
（1）标记3 个无菌试管 1 ， 2和3。

（2）分别向 3 个试管加入 10ml质差牛乳样品，生鲜牛乳样品和生鲜牛乳样品。

（3）分别向1和2各加入 1ml 美蓝溶液，塞紧管塞。

（4）轻轻倒转试管 4 次，置 37℃水浴锅中，并记录培养时间。

（5）试管在水浴中稳定 5min 后取出，轻轻倒转一次后在放回水浴中。

（6）每隔 30min 记录试管中美蓝颜色的变化，直至3~6h。

1.2.2 巴氏消毒牛奶
巴氏消毒在实际应用中，其温度范围较广，一般在63-90℃之间视消毒时间而定，本实验采用80℃ 15min。

（1）将水浴锅的温度调到 80℃。

（2）将生牛乳样品用力摇匀，使微生物能均匀分布。

（3）用 10ml 无菌移液管吸 5ml 放入灭菌试管内，然后将试管放入调好温度的水浴锅中（水面要超过牛乳的表面）。

（4）将试管放水浴内保持 15min，并不时摇动。

（5）一到15min，立即取出试管，用流动的自来水冲试管外壁，使其中的牛乳迅速冷却。

1.2.3 标准平板记数法
（1）将巴氏消毒的牛奶样充分摇匀，吸取 1ml 牛奶用蒸馏水稀释，稀释度依次为 10-2、10-3、10-4。

（2）用 1ml 无菌移液管从最大稀释度开始各取1ml 注入已标明样品和稀释度的空白平板内。

（3）各平板倾注约 15ml 已融化并冷却至 45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂，立即放桌上摇匀。

（4）凝固后倒置于 37℃温箱内，培养 24h。

（5）选择长有 30～300 个菌落的平板记数，并算出1ml 牛乳中的细菌总数。

（6）普通生牛奶样品的检查同上法，但稀释度为10-3、10-4、10-5。

2 结果与分析
2.1 试验结果
2.2.1美蓝还原实验法 1 号试管牛奶的还原时间为150min，2 号试管牛奶的还原时间为 270min，因此， 1 号试管牛奶为差质量，2 号试管牛奶为中等质量。

2.2．2 标准平板记数法 1 ml 巴氏消毒牛奶中的细菌数为 40490,1 ml 生鲜牛奶中的细菌数为5378673 , 可以看出巴氏消毒牛奶中的细菌数明显远远小于生鲜牛奶中的。

而生牛乳必须经过加工处理才能成为适合我们饮用的健康乳品。

3 讨论
3.1 美兰还原酶法在这个实验中，理论上来说一号试管中的蓝色应该较快退去，但是结果却不是这样的，一号试管中的蓝色经过了很长时间才逐渐变浅。

而二号试管中的蓝色也经过了较长的时间才慢慢变浅。

出现这种情况的原因我认为有以下几点：一、在将试管摇匀的时候没有摇匀，这样就导致了使试管中的蓝色分布不均匀，观察时就会出现一定的误差，但是，这样所导致的时间上的误差是可以避免的，这就需要在以后的实验操作中注意一些细微的操作；二、在美兰的移液过程中移液器枪头中可能会有气泡的存在，这就使美兰的量不同，所测得的时间也会有误差；三、可能在操作过程中试管二中的牛奶被污染了，这样也会造成实验结果的误差，在后续的实验中应该重视无菌操作，减少牛乳染菌的机会；四、可能是美兰溶液放置的时间过长，造成实际的效果明显下降，从而我们使用的美兰溶液的褪色效应会减弱，造成实验的误差；五、水浴锅的温度保持得不稳定，这就使得美兰溶液褪色的环境发生变化，如果温度低于37℃，牛乳中的一些蛋白失活，从而使呼吸作用减弱，就不能将美兰还原成无色的美兰；如果温度过高，也会使呼吸作用减弱，使美兰的还原反应减弱。

六、试管没有灭菌导致两种牛奶都被染菌导致结果差距不大。

3.2 标准平板菌落计数法在这个实验操作中，最容易出现的就是牛乳的污染。

在我们做出的实验结果中，就能明显地看出实验操作中的不足，这就使实验结果有了偏差，造成这些偏差的原因有以下几个方面：一、标准平板菌落计数法要求的无菌操作很严格。

在对浓度进行梯度稀释的时候应该注意，操作过程应该在酒精灯的无菌操作区中进行，移液器的使用和枪头的取用也同样要求无菌操作，并且在操作中应该注意到的是，试管塞全部是棉塞，棉塞容易燃烧，并且不容易取出，所以在操作的时候要多注意棉塞应该用纱布包裹棉塞，避免安全隐患。

倒板的过程中也是需要将培养皿的开口方向在酒精灯的无菌操作区中，并且在倒板过程中要尽量的快速，这样一来可以减少牛乳的污染，二来可以降低倒入平板中的培养基的温度。

倒完板后，要将平板水平推入试验台内；二、将稀释好的牛乳注入空的培养皿时，要保证取液的准确，将样液导入培养皿中时要轻轻地，避免样液洒出培养皿。

在将培养基倒入培养皿时，要轻轻摇动培养皿，使样液和培养基充分混合，避免培养后出现成团的菌落，不利于计数；稀释牛乳时，要多次摇匀后再进行稀释，避免菌落分部不均匀；三、在计数时会出现两种或两种以上的细菌形态，对菌落计数造成一定的困扰；四、在检测巴氏消毒后牛奶中的空白出现菌落可能是在倒培养基时离开无菌圈导致染菌；也有可能是取枪头时在无菌圈之外导致枪头染菌；灭完菌后我们的试管倒在灭菌锅中，取用时棉塞太少脱落有可能导致无菌水染菌；五、倒完板后，要静置一段时间，等培养基完全凝固后再放入培养箱中倒置培养，在从无菌操作室转移到培养箱时在包上报纸和拆报纸时导致培养基打开使得10-2 培养基和空白对照出现染菌。

3.3 这两种方法都是检查牛乳中细菌的方法，各有各的优点。

美兰还原酶法操作简便，可以对牛乳制品进行一个大致的分类；而标准平板菌落计数法是需要一段时间才能得出结果的，但是他所得出的结果是比较准确的，他有梯度稀释，有平行试验，重复性和平行性都很好，是很重要的一种细菌检验方法。

4 结论
牛乳的细菌学检查方法常用的有显微镜直接记数法、美蓝还原酶实验法、标准平板记数法。

美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法。

美蓝是一种氧化还原作用指示剂，在厌氧环境中，它将被还原为无色。

如果牛乳中有细菌生长繁殖，必将造成其中溶解氧的减少，牛乳样品中的氧化还原电势降低，通过加入其中的美蓝颜色变化的速度，可鉴定该牛乳的质量。

其标准规定为：（1）在 30min 内美蓝被还原为无色的样品为很差；（2）在 30min 到 2h 之间被还原者，为差质量；（3）在 2 到 6h 之间被还原者，为尚好或中等；（4）在 6 到 8h 之间被还原者，为优质牛乳。

标准平板记数法是广泛用于微生物计数的常规方法，此法较敏感，牛乳中有少量细菌时，能得出较正确的结果。

我国灭菌牛乳的卫生标准是用标准平板记数法检查，细菌总数小于 30000 个 /ml。

灭菌牛乳和生牛乳均适用标准平板记数法检测，尤其适用灭菌牛乳的卫生达标检测。

牛乳的营养价值非常高, 蛋白质和钙的含量都很高，可以满足人体所需要的各种氨基酸。

牛乳中可能含有致病微生物,如牛结核杆菌、布氏杆菌、沙门氏菌等, 因此在出售或饮用前一定要确保牛乳的品质, 对生鲜牛乳进行检查消毒和加工。

目前常用的消毒方法除采用巴斯德消毒法外 ( 将牛奶于62~63℃时处理30min，80℃时加热 15min) 还有高温消毒（将奶加热到60~90℃左右后在迅速降温）和超高温瞬时消毒（将新鲜牛奶在 120~140℃高温下加热 2~4s） . 现在法国又研制出牛奶长期保鲜新法，据介绍，这种新方法是先对新鲜牛奶进行脱脂，让脱脂奶经过孔径为 0.5μm 的特殊薄膜，过滤掉其中的微生物，最后再将脱脂后的奶在96℃保持 6s。

加热的目的不是杀菌消毒，而是为了使奶中的酶失去活性，避免在储存时变质。

采用新工艺加工的牛奶可以在常温下保鲜 4~6 个月，而且欧洲一些国家消费者品尝后认为其味道仍然鲜香。

现代工业生产的酸牛奶是先将牛乳进行巴斯德消毒，以消灭其中的有害菌，而后接种乳链球菌与乳杆菌的纯种发酵制成[10]。

牛乳经乳酸菌发酵其营养价值大大提高，并对人体确有保健作用。

它主要通过发酵菌和代谢产物中有益物质的作用起到调整促进消化吸收、促进肝机能、抑制有害菌，以及预防心血学、高血压病、糖尿病、癌症等作用。

5 注意
在实验前做好预习，对实验的流程和方法要充分了解和掌握，并对实验所需要的器材和试剂准备好；在实验过程中要注重细节的操作，注意团队合作和实验的顺序性；试验后对实验的结果做好分析，对实验中存在的不足和缺点做好总结并积极改正。

参考文献
[1][2][5][6] [8]沈萍,陈向东.微生物学实验.北京:高等教育出版社,2007:215-278.
[3] 周群英,高群耀.环境微生物学.北京:高等教育出版社,1998:188-196.
[4] 周德庆.微生物学教程.北京:高等教育出版社,2005:362-368.
[7] 王华,刘斌.PCR技术在食品微生物学中的应用.生物技术通报,2010(2).。