藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离纯化与鉴定

藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离纯化与鉴定
曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩
【摘要】One Acetobacter strain, FJAT-13797, was isolated from Tibetan kefir. The image under scanning electronic microscope showed that the bacterium was rod-shaped with round ends, and presented in single or pairs without spores. The strain showed the bio-chemical properties of Acetobacter spp. The 16S rDNA sequence analysis indicated that the strain, FJAT-13797, belonged to Acetobacter orientalis.%从藏灵菇中分离出醋酸菌株FJAT-13797,利用形态学观察、生理生化和16S rDNA方法对其进行细菌学鉴定,菌体形态为圆端直杆,单个或成对,无芽孢,其生理生化特征与醋杆菌属(Acetobacter)基本一致.经16S rDNA基因序列同源性比较和系统发育分析,菌株FJAT-13797鉴定为东方醋酸菌(Acetobacter orientalis).
【期刊名称】《福建农业学报》
【年(卷),期】2012(027)012
【总页数】4页(P1339-1342)
【关键词】藏灵菇;鉴定;醋酸杆菌;东方醋酸菌
【作者】曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩
【作者单位】福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003
【正文语种】中文
【中图分类】TS252
藏灵菇是一种乳白色、胶质状的块状物（由微生物产生的胞外多糖与乳蛋白聚合而成），外形酷似米粒，上面栖息着多种微生物，长期在牛奶中培养，个体会增大很多，形状如盛开的雪莲，有人称之为“西藏雪莲”［1－3］。

据传，用藏灵菇发酵生产的灵菇酸奶能提高免疫力，逐渐引起了人们的关注和重视。

不同来源的藏灵菇的菌相构成很复杂，而且微生物的分布存在着很大的差异，但其中主要是由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等组成的微生物共生体系［4］。

目前对藏灵菇的研究主要是针对于优势菌株乳酸菌和酵母菌的研究，而对于藏灵菇中的少数菌株醋酸菌的研究报道不多［5－9］。

醋酸菌主要分布于藏灵菇的表层，藏灵菇表层的微生物对于维持藏灵菇中的微生物共生体系的稳定性具有更加重要的意义［10］。

本研究从实验室保藏的藏灵菇中分离醋酸菌，肉眼观察该菌株的菌落形态特征以及扫描电镜下的菌株形态特征、生理生化特征等，并对菌株进行16S rDNA基因分子鉴定、序列同源性比对及其系统发育学分析，通过该研究希望为藏灵菇做为发酵剂纯培养研究及其工业化生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 菌株供试的藏灵菇样品是由福建省农业科学院农业生物资源研究所保藏。

1.1.2 主要培养基和试剂主要培养基有经过巴氏消毒后的新鲜牛奶，配制的改良MC液体或固体培养基和改良MRS液体或固体培养基［11］。

主要试剂有Biosopin细菌基因组DNA提取试剂盒，细菌微量生化鉴定管以及PCR扩增试剂等。

1.1.3 引物 16SrDNA的扩增引物和测序引物均是委托福州博鸿生物技术有限公司
合成。

其中的扩增引物序列对［12］：SEQ ID No.1：5′－GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；SEQ ID No.2：5′－AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA－3′。

测序引物序列对［12］：SEQ ID No.3：5′－AGCGGATCACTTCACACAGGA－3′；SEQ ID No.4：5′－GCAGAGTTCTCGGAGTCACGA－3′。

1.2 试验方法
1.2.1 藏灵菇发酵乳和菌悬液的制备经过无菌水洗净后的藏灵菇接种于经巴氏消毒后的新鲜纯牛奶中，在30℃培养箱中培养24h后，将过滤出的藏灵菇加入到巴氏消毒后的新鲜纯牛奶中再培养24h。

如此活化3次后即可做为藏灵菇的发酵乳。

吸取最后一次藏灵菇发酵乳的滤液1mL，用生理盐水制成10－4、10－5、10－6倍的稀释菌悬液。

1.2.2 醋酸菌的分离与纯化将 10－4、10－5、10－6倍的3个稀释梯度的菌悬液分别吸取0.2mL涂布于MC和MRS培养基平板上，每个梯度重复3次，置于30℃培养箱中培养48～72h，观察菌落形态特征。

然后将不同菌落特征的单菌落再进
行划板培养纯化。

1.2.3 醋酸菌的形态特征观察在 MRS和 MC培养基上经过纯化的醋酸菌的菌落形态，并用扫描电镜观察菌株电镜显微形态。

1.2.4 醋酸菌的生理生化特征用革兰氏染色法观察菌株的显微镜形态，对菌株进行过氧化氢酶的检测。

用API 50碳水化合物鉴定试剂条测定醋酸菌的生理生化指标。

1.2.5 醋酸菌菌株鉴定细菌基因组DNA的提取采用biosopin细菌基因组DNA
提取试剂盒，提取所得的细菌DNA做为模板，利用Taq酶和16S引物进行PCR
扩增。

PCR扩增程序：95℃5min，94℃30s，50℃ 30s，72℃ 60s，30个循环，72℃15min。

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后送福州博鸿生物技术有
限公司克隆、测序。

测序结果提交国际互联网GenBank，采用Blast软件进行相近序列的比对。

2 结果与分析
2.1 醋酸菌的形态学特征
经过分离纯化得到的醋酸菌菌株命名为FJAT－13797，该菌株在MC培养基上的菌落特征为淡粉色，菌落小，近似圆形，表面湿润，边缘比较整齐，微隆起，有明显的溶钙圈。

其在MRS培养基上的菌落特征为淡黄色，菌落小，近似圆形，表面湿润，边缘比较整齐，微隆起。

电镜显微形态观察结果显示，菌株FJAT－13797的菌体细胞为圆端短杆菌，长度为1.2～1.5μm，宽度为0.6～0.8 μm，单个或成对出现，没有芽孢。

图1 扫描电镜下菌株FJAT－13797的菌体细胞形态Fig.1 Cell morphology of FJAT－13797 under scanning electron microscopes
2.2 醋酸菌的生理生化鉴定
菌株FJAT－13797革兰氏染色反应呈阴性，接触酶反应呈阳性，不液化明胶。

其生理生化鉴定结果见表1。

菌株FJAT－13797不能够在pH 9.6的条件下生长，不能利用乳糖、葡萄糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、L－阿拉伯糖、D－阿拉伯糖、淀粉、卫矛醇、赤藓醇、肌醇、甘露醇、七叶苷、苦杏仁苷等，不氧化5－酮基－葡萄糖酸盐、2－酮基－葡萄糖酸盐。

该菌株的生理生化鉴定结果基本上符合醋杆菌属的生理生化特征［13－14］。

2.3 醋酸菌的菌株鉴定
菌株FJAT－13797的16SrRNA的PCR扩增产物测得的片段大小为1 395bp，在GenBank上的登录号为JN411498。

将该菌株的16SrDNA基因序列输入GenBank数据库，采用BLAST软件进行序列比对。

结果与菌株FJAT－13797的16S rDNA基因序列相似性高于99%的序列，全部都是醋杆菌属的16SrDNA的
基因序列，其中菌株FJAT－13797与Acetobacter orientalis （登录号为
AB180930）的16SrDNA的基因序列的相似性高达100%。

接着将该菌株与邻近属种的16SrDNA的基因序列进行系统发育学分析，从系统发育树（图2）中可以看出，菌株 FJAT－13797与A.orientalis的亲缘关系最为接近，因此确定菌株FJAT－13797为东方醋酸菌（A.orientalis）。

表1 菌株FJAT－13797的生理生化测定结果Table 1 Microbiochemical reactions of FJAT－13797注：“＋”表示阳性反应；“－”表示阴性反应。

图2 菌株FJAT－13797基于16SrDNA序列构建的分子系统发育树Fig.2 Phyogenetic tree based on 16S sequences and constructed using the neighbor－joining method for FJAT－13797
3 讨论
目前流行的灵菇酸奶是利用藏灵菇作为发酵剂发酵的牛奶。

藏灵菇中的微生物比普通酸奶中的微生物要复杂。

前人对藏灵菇中微生物的种群结构及发酵过程中的优势微生物进行了一些研究［15－17］。

本研究从藏灵菇中筛选分离出的菌株FJAT－13797确定为东方醋酸菌（A.orientalis）。

前人研究也曾从藏灵菇中分离到醋酸菌，如李剑等［18］从藏灵菇中分离出巴氏醋杆菌（A.pasteurianus）、醋化醋杆菌（A.aceti）和过氧化醋杆菌（A.peroxydans）。

但目前尚未见从藏灵菇中分离出东方醋酸菌的报道，这可能是由于藏灵菇中的微生物菌群组成比较复杂，当菌粒的培养条件不同或者来源不同时，其中的微生物组成差异比较大。

大多数的研究是对藏灵菇发酵乳中优势菌株的筛选，而没有筛选到或者是忽略了醋酸菌的筛选［19］。

参考文献：
［1］黄颖，杜娜，张垄，等.藏灵菇发酵乳中乳酸菌的分离纯化与鉴定［J］.中国实验诊断学，2010，14（4）：517－519.
［2］刘变芳，孔庆学，郭蔼光.自然发酵剂“西藏雪莲”的初步研究与菌种鉴定［J］.中国酿造，2004，（11）：11－13.
［3］周剑忠，董明盛，江汉湖，等.藏灵菇发酵奶发酵特性的研究［J］.食品科学，2006，27 （8）：29－33.
［4］林晓珊，吴虹，杨汝德.中华开菲尔共生菌的分离与鉴定［J］.现代食品科技，2009，25 （10）：1233－1235.
［5］杨希娟，樊明涛，师俊玲，等.西藏灵菇发酵乳中优势菌群的分离鉴定［J］.中国酿造，2007，6 （6）：52－55.
［6］杨宝兰，郑明珠.开菲尔粒在牛乳中发酵特性的研究［J］.中国医学检验杂志，2004，5 （4）：308－309.
［7］周剑忠，董明盛，江汉湖.PCR－DGGE指纹技术与分离技术结合筛选藏灵菇奶发酵过程的优势菌［J］.中国农业科学，2006，39 （8）：1632－1638. ［8］冯铄涵.藏灵菇发酵乳的营养功能及发酵特性研究现状［J］.中国奶牛，2012，（2）：35－38.
［9］周剑忠，黄开红，董明盛，等.开菲尔粒和西藏灵菇中细菌和酵母群落结构的比较［J］.江苏农业学报，2008，24 （5）：634－639.
［10］刘宇峰，王金英，曲小军，等.西藏灵菇菌的菌相菌学的研究［J］.中国乳
品工业，2005，33 （9）：35－39.
［11］中华人民共和国国家标准.GB／T 4789.35－2003.食品卫生微生物检验食品中乳酸菌检验［S］.北京：中国标准出版社，1996：273－280.
［12］张和平.一种适合乳酸菌16SrRNA序列测定的引物设计［P］.中国，200910250674.6，2010.05.12.
［13］BUCHANAN R E，GIBBONE E N.伯杰氏细菌鉴定手册［M］.中国科学院微生物研究所，译.第8版.北京：科学出版社，1984：797－830.
［14］东秀株，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：267－295.
［15］周剑忠，董明盛，江汉湖.藏灵菇微生物种群结构的分子特性研究［J］.微
生物学通报，2006，33（4）：64－68.
［16］KUO C Y，LIN C W.Taiwanese Kefir grains：their growth，microbial and chemical composition of fermented milk ［J］.Austra J Technol，1999 （54）：19－23.
［17］LIN C W，CHEN H L，LIU J R.Identification and characterization of lactic acid bacteria and yeasts isolated from kefir grains in Taiwan
［J］.Austra J Technol，1999，（54）：14－18.
［18］李剑，周剑忠，孙宇辉，等.藏灵菇中有益微生物的分离与鉴定［J］.江苏
农业科学，2009，27 （1）：242－244.
［19］ZHOU J Z，LIU X L，JIANG H H，et al.Analysis of the microflora in Tibetan kefir grains using denaturing gradient gel electrophoresis
［J］.Food Microbiology，2009，26 （8）：770－775.。