二烯丙基三硫主要代谢产物的合成及体内分析方法学的建立

DOI：10.16660/ki.1674-098X.2018.19.087
二烯丙基三硫主要代谢产物的合成及体内分析
方法学的建立①
张芳1 赵忠熙2 黄艳1*
(1.海南医学院药学院 海南海口 571199；2.山东大学药学院 山东济南 250012)
摘 要：合成二烯丙基三硫体内主要代谢产物并建立体内检测的方法学。

通过氧化方法合成二烯丙基三硫在体内的两种
主要代谢产物，甲基烯丙基亚砜（AMSO）和甲基烯丙基砜（AMSO
2
）。

采用气质联用法，以甲基异丙基苯(1-Methyl-4-
isopropylbenzene，MIB)为内标，建立体内分析的方法学。

经质谱和核磁结果验证，所合成目标产物为AMSO和AMSO
2。

AMSO和AMSO
2
分别在10～200μg/mL和5～100μg/mL浓度范围内线性关系良好。

专属性、回收率、精密度和稳定性考察均符合分析要求。

本文成功合成了二烯丙基三硫体内主要代谢产物并建立了体内分析的方法学，为该化合物的体内代谢动力学研究奠定基础。

关键词：二烯丙基三硫 代谢产物 体内药物分析 方法学
中图分类号：G64 文献标识码：A 文章编号：1674-098X(2018)07(a)-0087-04
大蒜是一种药食两用的自然资源，在我国有广泛种植。

国内外对该植物及其提取物的研究均较多。

研究发现，大蒜中主要活性成分为硫醚类，如二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚等。

硫醚类化合物具有多种药理活性，具有防治心血管疾病、抗肿瘤及抗病原微生物等多方面的作用[1]。

在所有的硫醚类化合物中，DATS被认为是在抗肿瘤效果最优的化合物[2]。

在体外抗肿瘤的研究中，研究者发现DATS通过周期阻断作用发挥杀伤肿瘤细胞的作用，同时也具有一定的诱导凋亡和产生活性氧的作用来加强杀伤效果[3]。

在体内抗肿瘤的研究中，建立PC-3、HepG2和CT26小鼠移植瘤模型的在体抗肿瘤效果研究中，给予DATS药物治疗后，相比于对照组肿瘤生长速度被显著抑制[4]。

从以上的研究结果来看，如果以IC50来评价抗肿瘤效果，DATS相较于一线药物紫杉醇，阿霉素等并没有显著优势。

但是，作为一种饭桌上的食材，几乎无毒副作用，即不会对正常细胞产生损伤。

因此，有机硫化合物在抗肿瘤领域具有广阔的发展前景。

前期对二烯丙基三硫化合物体内动力学研究发现，体内研究中很难监测到硫醚类原型药物。

硫醚类化合物是机体体内极其不稳定的化合物，主要表现就是化合物的半衰期极短，在接触体液时极易发生氧化还原化学反应。

文献报道，硫醚类主要通过s-c键断裂得AMS，而AMS极易在体液中极不稳定，可进一步被氧化而得砜或者亚砜。

硫醚类化合物在体内发生的这一系列氧化还原反应，也是其具有抗氧化性的主要原因[5,6]。

为更好地监测二烯丙基三硫化合物在体内动力学过程，本文体外合成其主要代谢产物，并建立其体内检测的方法学，为该化合物体内外研究提供物质基础。

1 仪器与试剂
色谱柱：A g i l e n t D B624石英毛细管柱(30m×0.32mm×1.80μm)。

烯丙基甲基硫醚(AMS)购自嘉兴思成化工有限公司；甲醇、二氯甲烷均购自国药集团有限责任公司；过碘酸钠、无水硫酸镁、过氧化氢均购自天津大成试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

2 实验方法
2.1 主要代谢产物的合成及结构鉴定
2.1.1 亚砜合成
按照等体积比配置甲醇：水溶液45mL，称取约0.11 mol的过碘酸钠，搅拌溶解到上述溶剂中，完全溶解后的溶液置于冰水浴。

用移液器取约0.1mol的AMS，加入到上述冰水浴中的溶液，并不断搅拌至反应结束。

反应结束后，用二氯甲烷多次萃取，萃取液用无水硫酸镁除水后，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到油状半固体物质。

取少量固体物质用合适溶剂溶解后，进行质谱和核磁结构确证。

以上实验主要参照文献进行[7]。

2.1.2 砜合成
在室温下，将30％H2O2（5m m o l，515μL）和 NaHCO3(0.2mol/L，17mL)均匀混合，得到①份混合溶液。

在室温下，精确地获得1mmol的AMS，并获得硫酸锰（2mg，1mol％）。

将两种溶液溶解在23mL乙腈中，混合溶液为②。

将溶液①加入溶液②中并继续搅拌。

根据参考文
①通讯作者：黄艳(1973,11—)，女，汉族，海南海口人，硕士，副教授，研究方向：药物分析及药物质量标准，E-mail:819681930@ 。

丰度
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图1 AMSO 质谱图丰度
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图2 AMSO2质谱图
献中的反应[8]，在搅拌几小时后加入10mL饱和盐水的反应。

将反应溶液用10mL乙酸乙酯萃取三次，与滤液合并，并使用不含水的硫酸镁除去有机溶剂中的过量水。

过滤后，旋转反应并干燥。

得油状半固体物质。

取少量固体物质用合适溶剂溶解后，进行质谱和核磁结构确证。

2.2 体内检测方法学建立
2.2.1 溶液配制
样品储备溶液配制：精密称取AMSO 500mg置于10mL 容量瓶中，二氯甲烷完全溶解，得到50mg/mL储备液并在4℃下储存。

将AMSO 100mg精确地置于10mL容量瓶中，并使二氯甲烷完全溶解。

获得10mg/mL储备溶液并在4℃下储存。

内标溶液：将精密内标MIB 12mg置于100mL容量瓶中，二氯甲烷充分溶解，浓度为1.2mg/mL储备液，保存在4C。

2.2.2 样品处理方法
精密吸取200μL，将含有AMSO、AMSO 2和内标的血浆样品置于1.5mL离心管中并混合。

加入10%μL三氯乙酸溶液60μL，涡旋沉淀血浆蛋白3min，用500μL正己烷涡旋提取3min，离心12000min，离心10min，吸入二氯甲烷下层。

根据GC-MS色谱条件对色谱进行分析。

2.2.3 提取回收率
取一定量被测药物对照溶液加入空白血样，配制成一血药浓度，按照血样处理方法处理后进样，得色谱峰面积A 1，另用纯溶液（多用流动相）配制与上述血药浓度相同的样品，进样测得色谱峰面积A 2，回收率%=A 1/A 2×100。

2.2.4 专属性试验
所有样品均在相同条件下处理。

在空白血浆和空白血浆中比较AMSO、AMSO 2和MIB和给药后的生物样品的检测信号，以研究内源性物质的干扰。

AMSO
AMSO 2
C(μg /mL)
Recovery(%)C(μg /mL)
Recovery(%)585.15±5.46585.57±1.612088.76±5.282084.64±3.27100
86.35±6.07
100
86.33±2.18
表1 AMSO和AMSO 2样品回收率
表2 AMSO样品日间和日内精密度
表3 AMSO 2样品日间和日内精密度
C(μg /mL)Intra-day
Inter-day
C(μg /mL)RSD%C(μg /mL)RSD%1012.17±0.56 4.6211.30±3.687.945040.51±1.29 3.2039.96±4.47 3.91200
192.86±10.01
5.19
196.19±7.44
2.29
C(μg /mL)Intra-day
Inter-day
C(μg /mL)RSD%C(μg /mL)RSD%5 3.64±0.5013.75 3.02±2.46 5.652022.75±0.77 3.3921.75±1.69 4.48100
948.76±6.4
6.8495.93±0.93
3.77
2.2.5 线性
将空白血浆180μL精密提取到1.5mL离心管中，加入10μL内标原液和10μL系列浓度标准溶液，旋流混合，按方法3处理血浆样品。

AMSO系列血浆浓度分别为5、10、20、50、100和200μg/mL，AMSO 2系列浓度分别为1、5、10、20、50和100μg/mL，所有样品中MIB浓度都保持在12μg/mL。

用GC-MS分析样品，记录峰面积。

在纵坐标上绘制测量样品（AMSO或AMSO 2）的峰面积（A S ）与内标MIB的峰面积（A i ）的比值，并在横坐标上绘制样品中的DATS的浓度，最后拟合曲线。

2.2.6 回收率和日间和日内精密度根据标准曲线法，制备了低、中、高质量浓度（10, 50, 200μg/mL）的三个质量控制样品（QC ）。

6个样品的每一个样品每天测量一次，连续3d。

计算日内精度和日间精度，并用相对标准偏差（RSD ）表示。

三种浓度样品的日间精密度和日间精密度RSD均小于15%。

精度表示在回收率方面，应该在85%～115%的范围内。

2.2.7 检测限和定量限取标准曲线下的最低点，一次稀释至较低浓度，按照标准曲线制备方法，将标准样品和内标溶液加入空白血浆中，并按照上述方法对血浆样品进行GC-MS测定。

通过信噪比（S/N ）确定了该检测条件下AMSO和AMSO 2的检出限和定量限。

当S/N＝3时，相应的药物浓度为检出限；S/N＝10，相应的药物浓度为定量限。

3 结果和讨论
3.1 代谢产物结构确证
3.1.1 质谱验证产物结构
得到了AMSO和AMSO 2的样品，乙腈完全溶解并稀释至合适的浓度，GC-MS得到的两个样品的质谱如下。

根据该结构，AMSO的分子量为104。

从图1的质谱来看，分子量
是正确的。

由于在GC-MS文库中没有相应的AMSO谱，所以不能匹配正确的结构。

同样，AMSO2的分子量为120。

从图2的质谱来看，分子量是正确的。

由于在GC-MS文库中没有相应的AMSO2谱，所以不能正确匹配结构。

这两种化合物的正确结构将通过核磁共振结果进一步确定。

3.1.2 核磁验证产物结构
得A M S O和A M S O2样品，氘代三氯甲烷溶解后，得到两个样品的核磁氢谱图。

对核磁数据进行归属，1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ 5.81(ddt,J=17.5，10.2，7.5Hz,1H),5.44～5.26(m，2H)，3.43(dd，J=12.9，7.3Hz，1H)，3.36(dd, J= 12.3，7.0Hz，1H)，2.48(s，3H)，鉴定结构为AMSO。

对核磁数据进行归属，1H NMR(400 MHz，CDCl3) δ 5.93(ddt，J=17.5，10.2，7.4Hz，1H)，5.46 (dd，J=21.3，5.3 Hz，2H)，3.72 (d，J = 7.4 Hz，2H)，2.85(s，3H)，鉴定结构为AMSO2。

3.2 血浆样品提取方法建立
3.2.1 专属性
按照以上样品处理的操作步骤，分别进行不同生物样品的处理，进行专属性考察。

结果可见，内标物与两个代谢产物均分离良好，在三个物质保留窗内，内源性物质无明显干扰，该方法可用于大鼠血浆样品的处理。

3.2.2 线性
AMSO和AMSO2分别在10～200μg/mL和5～100μg/ mL浓度范围内线性关系良好。

得AMSO的标准曲线为Y= 0.01312×X-0.03968，R2=0.9969，AMSO2的标准曲线为Y = 0.02013×X+0.05615，R2=0.9969。

3.2.3 回收率和日间和日内精密度
回收率反映了方法学的准确度。

体内生物样品的提取回收率一般要求大于80%，从表1结果可见，回收率测定均符合要求，可见该方法具有较高准确度。

精密度反映了方法学的可重复性。

精密度体内生物样品除含量定量下限点精密度要求在20%以内，其余点均要求在10%以内。

从表（表2和表3）中结果可见，两化合物在低中高3个浓度值，日间日内精密度均符合体内分析方法学的要求，可见，该方法可用于AMSO和AMSO2两化合物在体内大鼠血浆样品分析中。

3.2.4 检测限和定量限
根据信噪比确定物质的检测限和定量限。

AMSO和AMSO2在该方法学下的的检测限分别为1000ng/mL和500ng/mL，定量限分别为2000ng/mL和1000ng/mL
4 结语
通过简单的合成工艺合成了二烯丙基三硫醚在体内的两种主要氧化代谢产物，通过质谱和核磁两种方法对其结构进行验证。

建立了GC-MS SCAN全扫描模式下的体内样品分析方法学，为后期二烯丙基三硫醚体内代谢动力学研究提供方法基础。

参考文献
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