药物制剂教学实验：脂质体的制备及包封率的测定

脂质体电镜照片
多室脂质体电镜照片
脂质体冷冻蚀刻电镜照片
用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如大 豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等；合成磷脂，如二棕 榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等。 常用的附加剂为胆固醇。胆固醇与磷脂混 合使用，可制得稳定的脂质体，其作用是调节 双分子层的流动性，降低脂质体膜的通透性。 其他附加剂有十八胺、磷脂酸等。这些附加剂 能改变脂质体表面的电荷性质，从而改变脂质 体的包封率、体内外稳定性、体内分布等其他 相关参数。
2．盐酸小檗碱脂质体的制备(被动载药法)
【处方】
注射用豆磷脂 0.6 g 胆固醇 0.2 g 无水乙醇 2-3mL 盐酸小檗碱溶液(1mg/mL) 30mL 制成30mL脂质体
【制备】
(1)盐酸小檗碱溶液的配制 称取适量的盐酸小檗 碱溶液，用磷酸盐缓冲液配成1mg/mL和3mg/mL 两种浓度的溶液。 (2)盐酸小檗碱脂质体的制备 按处方量称取豆磷 脂、胆固醇置于100mL烧瓶中，加无水乙醇，余 下操作除将PBS换成盐酸小檗碱溶液外，同“空 白脂质体制备”，即得“被动载药法 ”制备的 小檗碱脂质体。
（二）实验部分
1．空白脂质体的制备（用于测定柱分离 度） 【处方】
注射用大豆卵磷脂 胆固醇 无水乙醇 磷酸盐缓冲液 0.9g 0.3g 2-20mL 适量
制成约30mL脂质体
【制备】
（ 1 ）磷酸盐缓冲液（ PBS ）的配制：称取磷酸氢二钠 （ Na2HPO4·12H2O ） 0.37g 与 磷 酸 二 氢 钠 （NaH2PO4·2H2O）2.0g，加蒸馏水适量，溶解并稀释至 1000mL（pH约为5.7），混匀。 （ 2 ）称取处方量磷脂、胆固醇，置于 100mL （也可以是 250、500或1000mL）烧瓶中，加无水乙醇1-2mL（根据 情况可以加 10或 20mL），置于65-70℃水浴中，搅拌使 溶解，于旋转蒸发仪上旋转，使磷脂的乙醇液在壁上成 膜，减压除乙醇，制备磷脂膜。 （3）另取PBS 30mL于小烧杯内，同置于65-70℃水浴中， 保温，待用。
Na+ Ber +
Na+
SO-3
－
Ber + －
Na+
－ Ber +
SO-3
Na+
Ber +
－ － －
SO-3
三、实验内容
（一） 实验材料与设备
1.实验材料:盐酸小檗碱、注射用大豆卵磷 脂、胆固醇、无水乙醇、95％乙醇、磷酸氢 二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、 NaHCO3、阳离子交换树脂。 2.实验设备与仪器:旋转蒸发仪、烧瓶、恒温 水浴锅、磁力搅拌器、吸耳球、光学显微 镜、玻璃棉、5mL 注射器筒、0.8μm微孔滤 膜、紫外分光光度仪、容量瓶等。
【注意事项】
(1) “主动载药”过程中，加药顺序一定不能颠 倒，加三种液体时，随加随摇，确保混合 均匀，保证体系中各部位的梯度一致。 (2) 水浴保温时，应注意随时轻摇，只需保证 体系均匀即可，无需剧烈振摇。 (3) 用冷水冷却过程中，应轻摇。
【质量检查】
粒子形态，最大粒径与最多粒径，药物的包 封率。
磷脂等膜材
水性介质
逆相蒸发法
系将磷脂等脂溶性成分溶于有机溶剂，如 氯仿、二氯甲烷中，再按一定比例与含药的缓 冲液混合、乳化，然后减压蒸去有机溶剂即可 形成脂质体。该法适合于水溶性药物、大分子 活性物质，如胰岛素等的脂质体制备，可提高 包封率。
在制备含药脂质体时，根据药物装载的机 理不同，可分为“主动载药” 与“被动载 药”两大类。 所谓“ 主动载药”，即通过脂质体内外水 主动载药 相的不同离子或化合物梯度进行载药，主要有 K+-Na+梯度和H+梯度(即pH梯度)等。 传统上，人们采用最多的方法是“被动载 药”法。所谓“ 被动载药”，即首先将药物溶 被动载药 于水相或有机相(脂溶性药物)中，然后按所选 择的脂质体制备方法制备含药脂质体。
outside neutral pH
inside acid pH
DH+ H+ D
DH+
H+ D
“主动载药”中pH梯度法载药原理示意图
评价脂质体质量的指标有粒径、粒径分布 和包封率等。其中脂质体的包封率是衡量脂质 体内在质量的一个重要指标。常见的包封率测 定方法有分子筛法、超速离心法、超滤法等。 本文采用阳离子交换树脂法测定包封率。 “阳离子交换树脂法”是利用离子交换作 用，将荷正电的未包入脂质体中的药物(即游 离药物)，如本实验中的游离小檗碱，通过阳 离子交换树脂吸附除去；包封于脂质体中的药 物(如小檗碱)，由于脂质体荷负电荷，不能被 阳离子交换树脂吸附，从而达到分离目的，用 以测定包封率。
【质量检查】
粒子形态，最大粒径与最多粒径，药物的包封 率。 【注意事项】同前。
3．盐酸小檗碱脂质体的制备(主动载药法)
【空白脂质体处方】 注射用豆磷脂 胆固醇 无水乙醇 柠檬酸缓冲液 0.9 g 0.3 g 2-3mL 适量 制成约30mL脂质体
【制备】
（1）空白脂质体制备 称取磷脂0.9g和胆固醇 0.3g ，加入无水乙醇，置于 65-70℃水浴中， 搅拌（或转动）使溶解，于旋转蒸发仪上旋 转，使磷脂的乙醇液在壁上成膜，减压除乙 醇。加入同温的柠檬酸缓冲液30mL，65-70℃ 水 浴 中 水 化 10-20min ， 取 出 脂 质 体 于 烧 杯 中，余下操作同“1.空白脂质体的制备”。 空白脂质体的制备 （2）主动载药 准确量取空白脂质体2.0mL、药 液 (3mg/mL)1.0mL 、 NaHCO3 溶液 0.5mL ，在 振摇下依次加入10mL西林瓶中，混匀，盖上 塞， 70℃水浴中保温 20min( 定时摇动) ，随后 立即用冷水降温至室温，即得。
四、实验结果与讨论
• 1．绘制显微镜下脂质体的形态图。 • 2．记录显微镜下可测定的脂质体的粒 径。 • 3．计算柱分离度与包封率。
脂质体检测结果
脂质体 类别
空白脂质体 被动法载药 脂质体 主动法载药 脂质体
形态
最大粒径 最多粒径 (μm) (μm)
备注
五、思考题
1.以脂质体作为药物载体的特点。请讨论影响脂 质体形成的因素。 2.从显微镜下的形态上看，“脂质体”、 “乳 剂”、“微囊”之间有何差别？ 3.如何提高脂质体对药物的包封？ 4.如何选择包封率的测定方法？本文所用的方法 与“分子筛法”、“超速离心法”相比，有何 优缺点？ 5.请试着设计一个有关脂质体的实验方案。本实 验方案还有哪些方面有待改进？
脂质体的制备方法
脂质体的制备方法有多种，根据药物 的性质或研究需要来进行选择。 ¾薄膜分散法 ¾注入法 ¾逆相蒸发法 ¾冷冻干燥法 ¾熔融法等
薄膜分散法
这是一种经典的制备方法，它可形 成多室脂质体，经超声处理后得到小单 室脂质体。此法优点是操作简便，脂质 体结构典型，但包封率较低。
注入法
注入法有“乙醚注入法”和“乙醇注入法” 等。“乙醇注入法”是将磷脂等膜材料溶于 乙醇中，在搅拌条件下慢慢滴入55-65℃含药 或不含药的水性介质中，蒸去乙醇，继续搅 拌1-2h，即可形成脂质体。
【附注】
（1）柠檬酸缓冲液 称取柠檬酸10.5g和柠檬 酸钠 7.0g 置于 1000mL 量瓶中，加水溶解并 稀 释 至 1000mL （ pH 值 约 为 3.8 ） ， 混 匀，即得。 （2）NaHCO3溶液 称取NaHCO3 50.0g，置 于 1000mL 量 瓶 中 ， 加 水 溶 解 并 稀 释 至 1000mL （ pH 值 约 为 8.0 ） ， 混 匀 ， 即 得。
注意：
在进行柱分离度实验前，需要用空 白脂质体对分离小柱进行饱和，具体操 作如下：量取0.2mL空白脂质体，置于分 离小柱顶部，待柱顶部的液体消失后， 仔细用 5mL PBS 进行洗脱，待液体滴尽 即可。
（3）包封率的测定
精密量取盐酸小檗碱脂质体 0.lmL 两份，一 份置 10mL 量瓶中，按柱分离度考察项下②进行 操作，另一份置于分离柱顶部，按 “柱分离度考 察 ” 项下③进行操作，所得溶液于 345nm 波长处 测定吸收度，按下式计算包封率。 包封率(％)=（ Al/At ）×100％ 式中，Al—通过分离柱后收集脂质体中盐酸 小檗碱的吸收度；At—盐酸小檗碱脂质体中总的 药物吸收度， At = A样×2.5 ，2.5为稀释倍数。
（ 4 ）取预热的 PBS 30mL ，加至含有磷脂膜的烧瓶 中，转动下， 65-70℃水浴中搅拌水化 10-20min 。 取出脂质体液体于烧杯内，置于磁力搅拌器上，室 温，搅拌30-60min，如果液体体积减少，可补加水 至 30mL ，混匀，即得。（整个过程也可在旋转蒸 发仪上完成，其它的脂质体制备也可在旋转蒸发仪 上完成。） （5）取样，在油镜下观察脂质体形态，画出所见脂 质体结构，记录最多和最大的脂质体的粒径；随后 将所得脂质体液体通过0.8μm微孔滤膜两遍，进行 整粒，再于油镜下观察脂质体的形态，画出所见脂 质体结构，记录最多和最大的脂质体粒径。
【注意事项】
(1)在整个实验过程中禁止用火； 禁止用火 (2)磷脂和胆固醇的乙醇溶液应 澄清，不能在水 澄清 浴中放置过长时间。磷脂和胆固醇的比例可以 采用4:1或5:1或6:1，如果磷脂和胆固醇的质 量不好，建议采用6:1； (3)磷脂、胆固醇形成的薄膜应尽量薄； (4)60-65℃水浴中搅拌水化10-20min时，一定要 充分保证所有脂质水化，不得存在脂质块。 不得存在脂质块
“被动载药”的共同特点是：在装载过 共同特点 程中脂质体的内外水相或双分子层膜上的药 物浓度基本一致，决定其包封率的因素为药 物与磷脂膜的作用力、膜材的组成、脂质体 的内水相体积、脂质体数目及药脂比(药物与 磷脂膜材比)等。 对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高的药 物，“被动载药”法较为适用。而对于两亲 性药物，其油水分配系数受介质的pH值和离 子强度的影响较大，包封条件的较小改变就 可能使包封率有较大的变化，此类药物首选 “主动载药”方法。