Western印迹方法测定血清中胰岛素样生长因子结合蛋白_3水平

论著
作者单位:100730中国医学科学院,中国协和医科大学,北京协和医院内分泌科
Western 印迹方法测定血清中胰岛素样生长因子结合蛋白 3水平
吴咏梅 邓洁英 史轶蘩
摘要 目的 研究正常人及生长激素分泌异常病人血清中胰岛素样生长因子结合蛋白 3(IGF BP 3)的水平。

方法 本文采用Western 印迹方法测定20例正常人,33例活动性肢端肥大症病人和34例特发性生长激素缺乏症(I GHD)病人血清IGF BP 3水平。

结果 正常成人血清中存在五种分子量不同的IGF BP,IGF BP 3含量为最高。

本文测定了20例正常成人和67例生长激素分泌异常患者血清IGF BP 3的相对光密度(R OD),正常人血清IG FBP 3含量为(1.1 0.4)ROD,活动性肢端肥大病人为(2.7 1.2)RO D,明显高于正常成人(P <0.01),IGHD 病人为(0.4 0.2)ROD,明显低于正常成人(P <0.01)。

血清生长激素与IGF BP 3、胰岛素样生长因子 I 与I GFBP 3均呈正相关(P <0.05)。

结论 Western 印迹测定血清IGFBP 3正常值和病理值提示IG FBP 3浓度的变化与生长激素功能状态密切相关,并依赖GH 。

关键词 蛋白印迹 胰岛素样生长因子结合蛋白 生长激素
Measurement of serum insulin like growth factor binding protein 3by Western blot W U Yongmei ,DENG Jieying ,SHI Yif an.Chinese Academy of Medical Science,Peking Union Medical College Hospital ,Beijing,100730
Abstract Objective To investigate serum insulin like growth factor binding protein 3(IGFBP 3)level in normal adults and patients with abnormality of growth hormone secretion.Methods Serum IGFBP 3levels in 20normal adults,33active acromegaly and 34patients w ith idiopathic grow th hormone deficiency (IGHD)were measured by Western blot.Results T here are five kinds of IGFBPs w ith different molecular weight in serum of normal adult.IGFBP 3was by far the major circulating binding protein.Serum IGFBP 3level was found to be elevated in active acromegaly and diminished in IGHD.The relative optical density units (ROD)of IGFBP 3were 1.1 0.4, 2.7 1.2and 0.4 0.2in normal adults,acromegaly and IGHD re spectively.There was positive correlation between grow th hormone and IGFBP 3and betw een insulin like growth factor I and IGFBP 3.Conclusion T he serum levels of IGFBP 3measured by Western blot may re flect the grow th hormone secreting status.Serum level of IGFBP 3may provide a useful index for grow th hor mone function.
Key w ords Western blot Insulin like grow th factor binding protein Growth hormone
(Chin J Endocrinol Metab ,1999,15:212 215)
生长激素(GH )对生长的促进作用由胰岛素样生长因子(IGFs)来介导,IGFs 在血液中绝大多数都与其结合蛋白(IGFBPs)结合,最近的研究表明,IGFBPs 不但起运载作用,而且对IGFs 的生物作用有重要的调节作用。

IGFBP 3与GH 轴的功能有密切的关系,本文建立血清IGFBP 3的测定方法,探讨在病理情况下,IGFBP 3与GH 功能的关系。

对象和方法
一、对象
1.正常组:20名,男女各10人,年龄19~45岁,为无肝、肾及内分泌疾病的健康献血者。

2.肢端肥大症组:33例,均为活动性肢端肥大症患者,男16人,女17人,年龄18~48岁,均有活动性肢端肥大症的临床表现,血GH 水平升高,空腹平均值为32 g/L,且不被口服葡萄糖试验所抑制。

3.特发性生长激素缺乏症(IGHD)组:34例,男19人,女15人,年龄5~17岁,身材矮小,左旋多巴和胰岛素低血糖GH 刺激试验血清GH 不能升高到10ng/m l 以上。

所有对象均要求空腹过夜后取血,取血后立即
放于4 ,分离血清,-20 保存待测。

二、方法
1.主要试剂:(1)IGFBP 3标准品:美国Diag nostic Systems Lab 赠送。

(2)IGFBP 3参考血清:为正常人混合血清,经IGFBP 3标准定量为6 g/ml,每次电泳时用量为5 l 。

(3)其它:丙烯酰胺购自Fluka 公司,硝酸纤维素膜(NC)购自Bio Rad 公司。

2.IGFBPs 的蛋白印迹(Western 印迹) 1 :(1)SDS PAGE:分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%的垂直电泳。

每次电泳的样品包括分子量标准、参考血清和被测血清样品。

样品中加入上样缓冲液,加热变性,恒压120V,电泳7~8小时。

(2)转膜:采用电转移装置,将电泳后凝胶上的血清成分转移到硝酸纤维素膜上,恒流100A,8小时。

(3)蛋白印迹反应:杂交反应液(含1%BSA,0.1%Tw een20, 125I IGF I 105cpm),置4 ,反应12小时。

(4)放射性自显影和读片:-80 自显影1~3天。

在激光扫描仪上读出自显影的强弱。

3.抑制实验:(1)在凝胶中线两侧对称样品孔中加入相同的血清样品,电泳。

(2)转膜后,沿膜中线剪开,则成为两张蛋白含量完全相同的NC 膜。

(3)一张膜与含 125I IGF I 反应液反应,另一张与含 125I IGF I 和过量的IGF I(约500ng )的反应液反应。

(4)压片,观察两张膜自显影的变化。

4.血清GH 和IGF I 的放免分析法:均采用本室建立的方法 2 ,测定IGF I 前对血清进行酸乙醇提取,以减少IGFBPs 对IGF I 测定的干扰,具体步骤略。

5.结果表示和统计学分析:每次实验都含有一个参考血清,将待检测血清样品与参考血清的自显影强度(以激光扫描仪计算出的自显影条带的面积作为自显影强度)的比值作为待检测血清的IGFBPs 的相对含量,以相对光密度(ROD)为单位。

GH 、IGF I 、IGFBP 3三者关系采用相关分析。

结 果
一、Western 印迹的方法学
1.IGFBPs 的量与自显影强度的关系:当以1.5,3.0,4.5和6.0 l 的正常人血清进行IGFBP 3Western 印迹分析后,其光密度(OD)则分别为0.2,1.2,
2.0,
3.5,见扫描图(图1)。

显示血清IGFBP 3含量与OD 值呈正相关(r =0.991,P <0.01)。

2.Western 印迹的特异性 抑制实验:由图2
图1 不同量血清中IG FBP 3Western 印迹放射性自显影扫
描图
Fig 1Scanning graph of IGF BP 3autoradiog ram by Western
blot in different volumes of serum
图2 IGF I 抑制125I I GF I 与I GFBP 3结合
Fig 2IGF I inhibites the binding o f 125 I I GF I and IGF BP 3
in the Western blot of sera
图3 正常人血清IG FBP Western 印迹结果Fig 3 Western blot of IG FBPs in serum of normal subject
可见当反应液中仅有 125I IGF I 时, 125I IGF I 与膜杂交自显影后显出的IGFBP 条带,而反应液中加入过量未标记的IGF I 时,与膜杂交经自显影后所有条带消失,可见未标记的IGF I 对 125
I IGF I 与IGFBPs 的结合有特异的抑制作用, 125I IGF I 与膜上蛋白的结合是特异的。

二、正常人血清的IGFBPs
正常人血清Western 印迹后出现五条带(图3),显示血清中可结合 125I IGF I 的IGFBPs 有五种不同的分子量,根据标准蛋白分子量推测它们的相对分子质量分别为41500,38000,34000,30000,24000,依次为IGFBP 3,3,2,1,4。

各种IGFBP 在血清中所占比例见表1,其中IGFBP 3在血清中占比例最大,占92.9%。

表1 各种I GFBPs 在血液中所占的比例Tab 1 Ratio of different kinds of I GFBPs in blood
IGFBP 自显影强度(光密度)
比例(%)OD
Ratio IGFBP 10.37 1.6IGFBP 2 1.00 4.5IGFBP 321.5092.9IGFBP 4
0.22
1.
图4 正常成人、肢端肥大症和IGHD 病人用W estern 印迹
测定的血清I GFBP 3水平
Fig 4Levels of serum IGFBP 3by W estern blot in normal
adults,acromeg aly and IGHD patients
三、GH 分泌异常疾病的血清IGFBP 3水平肢端肥大症和IGH D 病人血清IGFBP 图和正常人相同,均出现五条带,但Western 印迹结合显示肢端肥大症病人相对分子质量41500和38000条带的自显影强度增加,而IGHD 病人则41500和38000条带的自显影强度下降,与IGFBP 3参考血清比较,正常人IGFBP 3的ROD 值为1.1 0.4,肢端肥大和IGHD 病人IGFBP 3相对值分别为2.7 1.2及0.4 0.2。

这两组病人IGFBP 3水平与正常人有明显差异(P 均<0.01)。

四、GH 、IGF I 及IGFBP 3相互关系
1.人血清GH 的空腹值与IGFBP 3水平呈正
相关(r =0.36,P <0.005),肢端肥大症病人空腹GH 值与IGFBP 3水平呈更明显正相关(r =0.45,P <0.01)。

2.血清IGF I 水平与IGFBP 3水平呈正相关(r =0.26,P <0.05),肢端肥大症病人血清IGF I 与IGFBP 3的相关性更好(r =0.45,P <0.01)。

讨 论
IGFs 是一类具有广泛生理作用的生长因子,在血清中大部分IGFs 与IGFBPs 结合,IGFBPs 不仅作为运送IGFs 的载体,而且能调节IGFs 的生理作用,研究IGFBPs 对于阐明IGFs 的作用机理及IGFs 与疾病的关系有重要意义 3 。

Western 印迹研究IGFBPs 是目前常用的方法之一,Western 印迹结合了凝胶电泳分辨率高和固相免疫测定的特异、敏感、简便、稳定可靠等多种优点,可以研究凝胶电泳分离得到的蛋白条带和相应功能关系,对于组成复杂的IGFBPs,用Western 印迹方法可以同时了解不同生理情况下各种IGFBP 的变化,所需试剂较少,结果形象直观,所以本实验采用Western 印迹,并以 125
I IGF I 作为探针,杂交反应后经放射自显影可对IGFBPs 进行定量。

根据Western 印迹可以证明血清中存在IGFBPs,过量的IGF I 可抑制IGFBPs 与 125I IGF I 的结合,可见 125
I IGF I 与IGFBPs 的结合是特异的,受IGF I 竞争性抑制。

实验中发现,血清上样量少至1.5 l
都可以检测出其中的IGFBPs,由此看来,该方法是可靠的,灵敏、精密、特异性均符合要求,线性也比较好,可以定量测得血清中IGFBPs,对临床研究有重
要意义。

本实验发现血清经电泳,转膜,杂交反应后自显影,在X 光片上出现五条带,显示血清中可以结合IGF I 的基本结构单位至少有五种,充分说明IGFBPs 有几种不同分子量的类型,IGFBPs 在组成上具有异质性。

IGFBP 3是糖蛋白,可以有不同的糖基化形式,出现两条带,其中相对分子质量为41500和38000的条带非常深,每次实验都出现,显然是IGFBP 的主要条带,相对分子质量34000、30000、24000的条带浅,不是每次实验都出现,是次要的条带,各条带的自显影强度不同,根据自显影可以判断各种IGFBP 在血清中所占的比例,其中IGFBP 3带最深,IGFBP 2要弱得多,IGFBP 1和4更弱,表示IGFBP 3的含量最高,其次是IGFBP 2,再次是IGFBP 1和4。

血清中大部分为IGFBP 3,
占92.9%,其他种类的IGFBP只占小部分,与文献报道血清中IGFBP 3含量最高一致 4 。

本实验以相对光密度(ROD)作单位对血清IGFBP 3浓度进行定量 5 ,观察到肢端肥大症患者血清IGFBP 3水平明显高于正常人(P<0.01),而IGH D患者则相反,明显低于正常人(P<0.01),说明血清IGFBP 3水平也反映GH的分泌功能。

比较血清GH、IGF I、IGFBP 3三者之间的关系,肢端肥大症患者三者水平都升高,而IGH D患者三者水平都低。

三者在含量的变化上是一致的。

血清GH与IGFBP 3的水平呈正相关,肢端肥大症患者GH与IGFBP 3的相关性更显著,反映IGFBP 3对GH的依赖关系。

有报道,正常人与GH分泌异常的患者在深睡眠5.5小时内每半小时取一次血,以测定夜间自发的GH的分泌,GH的总分泌水平与血IGFBP 3水平显著相关 6 。

所以认为IGFBP 3同样可以反映GH的分泌功能,并可用于GH分泌异常疾病的诊断和治疗疗效的监测,本研究结果进一步证明了这个可能性。

IGF I水平有昼夜变化,还受营养等因素的影响明显。

相比之下,测定血清IGFBP 3似乎具有一些优点,它无昼夜节律,不易受营养的影响,在血清中水平稳定,并且水平较高,所以IGFBP 3有可能成为反映GH分泌功能更好的指标。

有作者报道,IGH D病人接受GH治疗后,放免测定IGFBP 3水平升高,Western印迹显示相对分子质量为41500和3800条带自显影加深,而肢端肥大症病人用生长抑素治疗后,放免测定IGFBP 3水平下降,病人血液中IGFBP 3的改变非常迅速。

GH分泌异常病人治疗恢复正常时,West ern印迹显示IGFBPs的各种形式的自显影强度恢复正常 6 。

所以IGFBP 3不仅可用于GH分泌异常的诊断,它还可用于监测病人治疗效果。

最新研究表明IGFBP 3可以通过特异的受体发挥作用 7 。

本实验建立了Western印迹测定血清IGFBPs 的方法,证实了血清中IGFBPs的存在,正常人血清IGFBPs有五种不同分子量的形式,其中IGFBP 3含量最高,用Western印迹测定血清IGFBP 3正常值和病理值测定结果表明IGFBP 3浓度的变化与GH功能状态密切相关,依赖GH。

血清IGFBP 3的测定对于深入研究GH轴各水平的关系有重要意义,同时也是GH分泌异常诊断上的一个有用的指标。

该方法需要的血量少、特异、简便易行,可用于临床研究。

参 考 文 献
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(收稿:1998 08 25 修回:1999 05 17)
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