高尔基体磷蛋白3通过促进细胞自噬抑制紫杉醇诱导的hela细胞凋亡

高尔基体磷蛋白3通过促进细胞自噬抑制紫杉醇诱导的hela
细胞凋亡
王镇南; 郑玉菡; 黄海丽; 何惠娟; 贾庆明
【期刊名称】《《南方医科大学学报》》
【年(卷),期】2019(039)011
【总页数】7页(P1280-1286)
【关键词】紫杉醇; 化疗; 自噬; 高尔基体磷蛋白3
【作者】王镇南; 郑玉菡; 黄海丽; 何惠娟; 贾庆明
【作者单位】广东医科大学附属医院肿瘤中心广东湛江 524001; 广东医科大学附属医院临床研究中心广东湛江 524001
【正文语种】中文
高尔基体磷蛋白3（Golph3）参与调控高尔基体蛋白分选和运输，维护高尔基体
结构稳态[1-3]。

同时它还是一个癌基因，在多种肿瘤组织中表达异常升高[4-7]。

Golph3 的高表达与肿瘤进展程度、预后不良密切相关[8-11]。

最近的研究表明Golph3影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[12-14]，但具体机制仍不完全清楚。

我们的前期研究表明，Golph3在宫颈癌组织中高表达，Golph3可以促进宫颈癌
细胞的增殖、迁移和侵袭。

另外，Golph3的表达水平与紫杉醇处理后宫颈癌细胞的增殖密切相关。

上调Golph3的表达，紫杉醇对宫颈癌细胞杀伤作用降低。

但是，具体的作用机制仍不清楚。

肿瘤的化疗和放疗过程中会诱导自噬的发生[17-19]。

多数研究证实自噬在化疗过
程中发挥保护作，自噬能通过降解大分子废物、错误折叠的蛋白和损伤的细胞器来维护细胞内部稳态，为肿瘤细胞提供能量和营养元素[15-16]。

这提示，自噬可能
是紫杉醇处理条件下Golph3调控宫颈癌细胞增殖的一种作用机制。

因此，本研究主要探讨Golph3是否通过影响细胞自噬调控紫杉醇引起的肿瘤细胞凋亡。

1 材料和方法
1.1 常用试剂
Hela细胞（ATCC）；胰酶、胎牛血清和MEM培养基（Gibico）；一抗稀释液
和二抗稀释液（碧云天生物技术有限公司）；细胞培养耗材、细胞凋亡检测试剂盒（C1062M）、PVDF膜化学发光试剂盒和其他常规生化试剂（东莞科贸生物科技有限公司）；自噬抑制剂3-MA（IM0190）（北京索莱宝科技有限公司）；带有
V5标签的Golph3 过表达慢病毒由本课题组构建并保存；靶向Golph3的siRNA （上海吉玛制药技术有限公司）。

siRNA序列：GOLPH3-si635 sense
5'CAAGAAAGGUAAUC UGUAATT3'；anti-sense 5'UUACAGAUUACCUUUC UUGTT3'。

V5标签抗体、GAPDH基因抗体和HRP标记二抗（CST公司）；Golph3基因抗体（Abcam）。

1.2 稳定细胞株的构建
通过慢病毒感染的方法构建过表达Golph3蛋白的hela稳定细胞株。

病毒感染前
1 d，按5×103/孔的密度将hela细胞接种至24孔板。

第2天，使用MOI=20
慢病毒感染hela细胞。

慢病毒感染细胞时培养基加入终浓度为5 μg/mL的polybrene。

感染12 h后吸出含有病毒液的培养基，换上完全培养基培养。

24 h 后，加入含有嘌呤霉素的培养基进行筛选。

嘌呤霉素筛选2～3周后选出阳性克隆，通过免疫印记检测阳性克隆中Golph3蛋白表达水平。

1.3 透射电镜样品处理
透射电镜样品由广东医科大学附属医院电镜室制备。

胰酶消化法收集细胞，去除上清，在细胞沉淀中缓缓加入戊二醛固定液，固定过夜。

第2天去除固定液。

PBS
洗3次，然后吸干上清。

依次用50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇、90%丙酮、90%丙酮和100%丙酮进行脱水。

树脂包埋和固化。

超薄切片机切片，厚度约50～60 nm。

3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色。

透射电镜（JEM1400，日本电子）观察、拍片。

1.4 免疫印记
通过SDS-PAGE分离蛋白，蛋白电泳上样量为30μg，100 V稳压电泳2 h，300 V稳压电泳0.5 h，300 mA稳流转膜1 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜4次，5 min/次，HRP标记二抗室温孵育1 h，TBST洗膜4次，5 min/次，化学发光成像。

1.5 siRNA转染
将5×104细胞种植于6孔板，培养过夜。

转染前将六孔板中的细胞培养基吸干，加入1 mL OPTI-MEM培养基，放入二氧化碳培养箱内培养。

按照如下体系配置
转染液：（1）1.5 mL EP 管内加入6 µL siRNA 或对照siRNA（NC）和100µL OPTI-MEM培养基，混匀后静置5 min；（2）另取新的1.5 mL EP管内加入
3µL转染试剂LIPOFACTAMINE2000和100µL OPTI-MEM培养基，混匀后静置5 min；（3）将（2）管中溶液加入（1）管，混匀后静置20 min，此为siRNA
转染液。

将转染液加入六孔板中，摇匀后放入二氧化碳培养箱内培养。

6 h后取出六孔板，吸干板中液体，加入含有10%胎牛血清的1640培养基，放入二氧化碳
培养箱内培养。

1.6 细胞凋亡检测
siRNA转染后，自噬抑制剂3-MA预处理转染后的hela细胞3 h，然后再使用紫杉醇处理细胞24 h。

胰酶消化细胞，将细胞收集到15 mL离心管（前面提到的收
集培养上清的离心管）。

1000 r/min离心5 min。

去掉上清，加入195µL Binding buffer重悬细胞，将细胞悬液转移至1.5 mL EP管。

加入5µLAnexin V
染色液，混匀，避光孵育5 min。

加入5µL PI染色液，混匀，避光孵育15 min。

加入195µL Binding buffer，混匀后使用流式细胞仪进行检测。

1.7 统计方法
选用Graphpad Prism6.0统计软件，采用非配对t检验对实验组和对照组的数值
进行统计分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 hela细胞Golph3表达检测
免疫印迹结果显示，在37 000～40 000左右的位置，Golph3稳定细胞株组出现一条特异性条带，而对照组（vector）没有（图1A）。

与NC组相比siRNA组Golph3蛋白的内源表达显著降低（P＜0.05，图1B）。

2.2 Golph3对细胞自噬小体的影响
透射电镜观察结果显示，紫杉醇处理后hela细胞内可观察到自噬小体；自噬小体
内含有未消化的线粒体。

与对照组（vector）相比，Golph3组细胞中自噬小体的数量增多（图2A）。

与NC组相比，siRNA组细胞中自噬小体的数量减少（图
2B）。

2.3 Golph3对自噬标记物表达的影响
免疫印迹结果显示，Golph3组细胞中自噬标记物LC3II表达减弱，p62表达升高（图3A）；与NC组相比，siRNA组细胞中LC3II升高，p62表达减弱（图
3B）。

2.4 Golph3对细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测结果显示，与vector 组相比，Golph3组细胞凋亡率显著降低（P ＜0.01，图4A）；与NC组相比，siRNA组细胞凋亡率升高（P＜0.01，图4B）。

2.5 自噬抑制剂3-MA对hela细胞自噬和凋亡的影响
图1 Hela细胞Golph3表达检测Fig.1 Expression of Golph3 in HeLa cells. A: HeLa cells were infected by the lentivirus expressing Golph3 or the control lentivirus and treated with puromycin to screen the positive cells expressing Golph3.The over-expression of Golph3 in stable cell line was verified by Western blot analysis(GAPDH was used as loading
control);B:HeLa cells were transfected with siRNA targeting Golph3 or NC,and the expression of Golph3 in HeLa cells was determined by Western blotting.***P＜0.05 vs NC or vector.
图2 透射电镜观察自噬小体Fig.2 Effect of modulation of Golph3 expression on autophagy in HeLa cells.A: HeLa cells were infected by the lentivirus expressing Golph3 or the control lentivirus and treated with puromycin to screen the positive cells expressing Golph3;B:HeLa cells were transfected with siRNA targeting Golph3 or NC and treated with 1 μmol/L paclitaxel
for 24 h. The autophagic bodies were examined using transmission electron microscope.
流式细胞仪检测结果显示，与对照组DMSO相比，3-MA 处理组细胞凋亡率无显著变化（P=0.1149，图5A）。

透射电镜结果显示，与对照组DMSO相比，3-MA处理组细胞自噬小体数量无显著变化（图5B）。

免疫印记检测结果显示，与
对照组DMSO相比，3-MA处理组LC3II表达降低，而p62表达升高（图5C）。

2.6 自噬抑制剂3-MA处理后下调Golph3表达对细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测结果显示，siRNA组细胞凋亡率高于NC组（P＜0.01，图6A）；透射电镜结果显示，与NC组相比，siRNA组细胞中自噬小体的数量减少（图
6B）；免疫印记检测结果显示，与对照组NC组相比，siRNA组LC3II表达降低，
而p62表达升高（图6C）。

3 讨论
研究表明，自噬是调控肿瘤细胞对化疗药物敏感性的一种重要机制[16-20]。

对肿
瘤细胞而言自噬是一把双刃剑，一方面过度的自噬可诱导自噬性细胞死亡，另一方面自噬对肿瘤细胞有保护作用，通过将自身坏死的细胞器和错误折叠的蛋白质降解，重新利用养分维持癌细胞生存，造成了对化疗药物的耐受[21-23]。

Golph3是高
尔基体基质蛋白，主要定位于反式高尔基体膜上[24]。

它参与调控高尔基体蛋白运输和分选，维护高尔基体结构和内部稳态[1-2,25]。

最近的研究发现，下调
Golph3表达可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[13,26]。

抑制Golph3表达可增强结肠癌细胞HT29对化疗药物5-FU和顺铂的敏感性[13,26]。

本研究首次报道Golph3通过调控自噬影响宫颈癌细胞的紫杉醇敏感性。

本研究结果显示上调宫颈癌hela细胞中Golph3的表达，可以促进细胞自噬；而下调Golph3的表达则抑
制hela细胞自噬。

本研究还发现，使用抑制剂3-MA预处理hela细胞，并同时
下调Golph3的表达，可以提高紫杉醇引起的hela细胞的细胞凋亡率。

这提示，Golph3可能调控细胞自噬影响紫杉醇引起的细胞凋亡。

Golph3可成为紫杉醇化
疗的分子靶点。

图3 免疫印记检测自噬标记物表达Fig.3 Effect of Golph3 overexpression and knockdown on expressions of LC3II and p62 in HeLa cells.A:HeLa cells were infected by the lentivirus expressing Golph3 or the control lentivirus and treated with puromycin to screen the positive cells expressing
Golph3;B:HeLa cells were transfected with the siRNAtargeting Golph3 or NC and treated with 1 μmol/L paclita xel for 24 h.The expressions of autophagy marker LC3II and p62 were examined by Western
blotting(GAPDH was used as the loading control).**P＜0.05 vs NC or vector.
目前自噬的研究主要集中在3个领域：自噬体膜的来源问题；细胞器自噬，特别是线粒体自噬；beclin1复合物的形成和调控蛋白以及信号通路在自噬中的作用。

我们目前的研究结果仅仅提示Golph3对细胞自噬有促进作用，其具体机制仍有待进一步研究。

国外的研究表明Golph3在线粒体也有表达并且执行一定的功能。

有研究报道，线粒体中富含Golph3，线粒体DNA消耗之后将引起Golph3表达增加[27]。

本研究通过透射电镜的观察发现，紫杉醇处理宫颈癌细胞后，自噬小体里面含有未被完全消化的线粒体。

而上调Golph3表达后，hela细胞自噬小体数量增多。

因此本研究推测Golph3可能对线粒体自噬有调控作用。

但是，目前的结果仍不能解释Golph3通过什么机制影响线粒体自噬。

我们将在后续研究中探讨Golph3对线粒体自噬的影响和分子机制。

图4 过表达或干扰Golph3对细胞凋亡的影响Fig.4 Paclitaxel-induced apoptosis in HeLa cells with Golph3 overexpression(A)and
knockdown(B).A:HeLa cells were infected by the lentivirus expressing Golph3 or the control lentivirus and treated with puromycin to screen the positive cells;B:HeLa cells were transfected with the siRNA targeting Golph3 or NC and treated with 1 μmol/L paclitaxel for 24 h.The total cell apoptosis were examined using PI/Anexin V-FITC double staining and flow cytometry.**P＜0.01 vs NC or vector.
图5 自噬抑制剂3-MA对hela细胞自噬和凋亡的影响Fig.5 Effects of the autophagy inhibitor 3-MAon apoptosis and autophagy of HeLa cells.Hela cells were pretreated with autophagy inhibitor 3-MA for 3 h.A:Total cell apoptosis examined using PI/Anexin V-FITC double staining and flow cytometry; B: Autophagic bodies examined using transmission electron microscope; C: Expressions of autophagy marker LC3II and p62 examined
by Western blotting(GAPDH as the loading control).
图6 自噬抑制剂3-MA处理后下调Golph3表达对细胞凋亡的影响Fig.6 Autophagy inhibition enhances the effect of siRNA on apoptosis.Hela cells were transfected with the siRNA targeting Golph3 or the control
siRNA(NC).The transfected cells were pretreated with autophagy inhibitor 3-MA for 3h,and then treated with 1 μmol/L paclitaxel for 24 h.A:Tota l cell apoptosis examined using PI/Anexin V-FITC double staining and flow cytometry,**P＜0.01 vs NC;B:Autophagic bodies examined using transmission electron microscope;C:Expressions of LC3II and p62 examined by Western blotting.
研究报道Golph3可激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR信号通路，并调节癌细胞对mTOR抑制剂雷帕霉素的敏感性[12,28]。

mTOR信号通路是调控细胞自噬的一个重要通路。

mTOR可磷酸化ULK1的Ser757位点并抑制ULK1的活化，最终抑制细胞自噬[29-30]。

这提示，Golph3可通过mTOR信号通路调控紫杉醇诱导的细胞自噬
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