qPCR重复性差

qPCR重复性差
你的体系扩增效率多少？有⾮特异性扩增吗？
唔…不知道…
没有这些验证数据，就做正式样本了？…（此时，⼀万点鄙视）
司姐开启⽼司机教导模式
以下Tips请记笔记
qPCR作为分⼦⽣物学研究的常规⽅法之⼀，每年有⼤量基于qPCR的数据发表。

然⽽时⾄今⽇，实验过程中仍然经常存在很多不规范的现象，从⽽导致qPCR结果重复性差、可信度较低、结果参差不齐。

要想得到可信任\可重复的qPCR数据，qPCR前的优化和验证必不可少。

qPCR优化
退⽕温度优化
退⽕温度关系到pcr反应的扩增效率，甚⾄特异性，寻找合适的退⽕温度是qPCR前的必备步骤，⼀般的⽅式推荐梯度退⽕温度实验，在同⼀实验中做8个重复样本，预设为从⾼到低8个不同退⽕温度（例如50-65度），特殊实验也可放宽范围, ⼀般建议在引物设计的退⽕温度上⾯加10C下⾯减6C，约16C的范围，观察最后结果选择Cq值⼩且平台期荧光强度最⾼的那个温度为最佳退⽕温度（扩增效率⾼且产量⾼）。

引物浓度优化
引物浓度也是影响qPCR实验的关键因素，影响着反应效率和稳定性，建议进⾏引物优化，可以设置引物梯度浓度实验，寻找最佳上下游引物浓度.
qPCR验证
在进⾏qPCR实验前需要对反应体系的特异性、反应效率、R²、线性范围、检测下限等进⾏验证，符合qPCR的条件，⽅可后续实验。

特异性性验证
检测特异性的⽅法：熔解曲线、琼脂糖凝胶电泳、酶切等。

可通过分析熔解曲线的峰的位置及峰的多少来判断特异性。

如下图 A中仅有⽬标产物的单⼀峰即特异性良好，B、C有⾮特异条带，也可跑电泳分析条带来判别.
反应效率、R²、线性范围验证
反应效率、R²、线性范围等指标可以通过⼀个标准曲线实验得到。

梯度稀释标准品然后做qPCR实验得到的结果绘制成标准曲线（如下图），得到该标准回归直线的⽅程式
（y=mx+C，R²）其中斜率 slope即m，扩增效率Efficiency = 10(–1/slope) –1，qPCR对扩增效率的要求⼀般为90%-110%，R²要达到0.98以上,得到的数据才相对可靠。

另从标准曲线也可得到检测的线性范围(3-3×1010copies)及检测下线(3 copies)。

好了，qPCR的优化和验证其实很简单吧，对于⼀种反应体系，只需实验前做⼀次优化和验证即适⽤同⼀种反应体系的所有样本检测，⼀劳永逸，不要再偷懒省掉哦.。