两种球形棕囊藻细胞总RNA提取方法的比较_cropped

两种球形棕囊藻细胞总RNA提取方法的比较_cropped ()Vo l. 27 No. 3 第 26卷第 3期自然科学版暨南大学学报
()Jou rna l of J inan U n ive rsity N a tu ra l Sc ience 2006年 6月J un. 2006
两种球形棕囊藻细胞总 RNA 提取方法的比较
1 2 2彭喜春 , 杨维东 , 刘洁生
()暨南大学 1. 食品科学与工程系 ; 2. 生物工程系 ,广东广州 510632 [摘要 ] 不同植物细胞 RNA 提取的适宜方法各不相同 . 本实验分析、比较了 Q IA GEN 试剂盒法
( )和西曲溴铵 CTAB 法用于赤潮藻细胞总 RNA 提取的情况 . 结果显示 ,两种方法均可获得高质量的总 RNA. 比较而言 , CTAB 法比 Q IA GEN 试剂盒更可取 ,适合藻细胞 RNA 的大量提取 .
[关键词 ] RNA 提取 ; 赤潮藻 ; 球形棕囊藻
() 文章编号 ] 1000 - 9965 200603 - 0493 - 04 [[中图分类号 ] Q949. 2 [文献标识码 ] B
C om pa r ison of two m e thod s of to ta l RNA iso la t ion
from P h a eocys tis g lobosa 1 2 2PEN G X i2chun, YAN G W e i2dong, L IU J ie2sheng
( 1. Co llege of Food Sc ience and Techno logy;
)2. Co llege of B io logy Techno logy, J inan U n ive rsity, Guangzhou 510632 , Ch ina [ A b stra c t] The m e thod s of to ta l RNA iso la tion a re va ried fo r the d iffe ren t p lan t ce lls. In th is p ap e r, two m e thod s of to ta l RNA iso la tion, Q IA GEN to ta l
RNA iso la tion k it and CTAB iso la tion buffe r so lu tion, we re comp a red when u sed fo r red a lga l ce lls. It wa s found tha t bo th the two m e thod s cou ld iso la te good to ta l RNA. Howeve r, CTAB m e thod is be tte r su it2 ab le fo r the sub stan tive RNA iso la tion from red tide a lgae.
[ Key word s] to ta l RNA iso la tion; red tide a lgae; Phaeocystis g lobosa she rffe l 近年来 ,赤潮在我国沿海频繁暴发 ,赤潮藻类分子生物学的研究引起了人们的高度重视 . 微藻是引发海洋
赤潮的主要生物 . 微藻具有细胞壁 ,是一类单细胞植物 ,其 RNA 的提取多采用草本植物、细菌或酵母细胞使用 [ 1 - 2 ] 的方法 . 但赤潮藻类细胞含有较多的黏性多糖物质 . 这些多糖类物质不仅影响提取效率 ,而且严重干扰以 [ 3 - 4 ] 后的反转录、酶切和体外扩增 . RNA 的质量直接影响和制约着随后的
分子操作和实验结果 , 如何提高
RNA 纯度 ,经济而快捷地获得足够量的 RNA 对藻类分子生物学的研究十分重
要 .
提取 RNA 的方法很多 ,但是具体运用到不同的细胞时 ,由于细胞结构的差异 ,不同提取方法所获得全长
( )RNA 的效果也不同 . 本实验以赤潮藻球形棕囊藻 Phaeocystis g lobosa 为例 ,比较了 RNA 提取方法应用于赤潮
藻类总 RNA 提取的效果 .
2005 - 09 - 06 [收稿日期 ] ( ) ( )( )国家自然科学基金 30470321 、广
东省自然科学基金重点项目 021168 和广东省自然科学基金 031885 [基金项目 ] ( ) 彭喜春 1976 - ,男 ,博士 ,讲师 ,主要从事功能生物分子与生物安全研究. 通讯联系人 : 刘洁生[作者简介 ]
1 材料
1. 1 藻种
( ( )) 球形棕囊藻 Phaeocystis g lobosa She rffe l汕头 ST株系由暨南大学生物系江天久副教授提供 .
1. 2 主要仪器与试剂
() () LRH - 250 - GS人工光照气候箱广东省医疗器械厂、200V Fa stP rep 核酸提取仪 Q b iogene公司、SW -
() () CJ - 1BU 型超净工作台苏州净化设备有限公司、80 - 2B 型台式离心机上海安亭科学仪器厂制造、D YY
() () - 6B 型稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂、D YCP - 31A 型电泳槽北京市六一仪器厂 .
() () 海盐产自澳大利亚 A qua son ic公司 ,总 RNA 提取试剂盒 Q IA GEN 公司 ,焦碳酸二乙酯 D EPC 、西曲溴( ) (β () ( β )铵 CTAB 、PEG4000、- 巯基乙醇 - M E均为生化试剂购自鼎国生物技术有限公司 ,琼脂粉 Shangha i ) Yito En te rp rise Comp any L im ited,其它均为分析纯 .
1. 3 RNA 酶的灭活
) ( 用于提取 RNA 的器皿用质量分数 011% D EPC处理三蒸水 25 ?过夜 ,然后以 1. 1 M Pa 121 ?高压灭菌 20 m in,以灭除 RNA 酶活性 .
1. 4 C TA B法 RNA 提取缓冲液的配制
) ( ) ( () 配制 100 mL:质量分数 2% CTAB 西曲溴铵 2 g, 10 mL 1 mo l /L Tris - HC l pH 815 , 20 mmo l /L 乙二
( ) ( ) ( ) ( ) 胺四乙酸 ED TA 0. 584 5 g, 1. 4 mo l /L N aC l 8. 19 g,体积分数 1 %聚乙醇 4000 PEG4000. 混匀灭菌 ,室
β温保存 . 使用前加入 - 巯基乙醇至最终体积为 15 %.
2 方法
2. 1 藻种培养[ 12 ]( )所用培养液根据 f /2培养液 Gu illa rd, 1973改
良配方由人工海水加营养盐配制而成 . 配制好的培养
μ基用 0. 22 m 微孔滤膜过滤灭菌 ,收集 1. 5 L 滤液于锥形瓶中 . 取对数生长末期球形棕囊藻 ,用血细胞计数 5 板计数并计算其细胞密度后接种 , 接种密度约为115 ×10/mL. 接种后置于人工气候箱中培养 , 培养温度 - 2 - 1 μ()22 ?,光照强度为 200 mo l ?m ? s,光暗循环为 L ?D = 12 h?12 h. 培养 10 d后生长平稳期离心收集藻细胞 .
2. 2 试剂盒提取法
根据 Q IA GEN 总 RNA 提取试剂盒使用说明书 ,以植物细胞的操作程序进行
提取 ,并稍作修改 . 具体操作如下 : 6 ( )() 1 藻细胞的收集 . 离心收集 200 mL密度为116 ×10/mL 的生长平稳期培养物的藻细胞约 100 m g.( )()2 藻细
胞的破壁及 RNA 的溶解 . 加至装有瓷珠由 Q b iogene提供及少许石英砂的
Fa stp rep 管中 ,再加μ()入 450 L RL T或 RLC缓冲液 . 然后于 Fa stP rep FP120 Q b iogene在 515级下振荡约 15 s,简单离心 . ( ) 3 RNA 的分离 . 以下操作按“Q IA GEN 总 RNA 提取试剂盒使用说明书”操作 .
( ) 4 RNA 的纯化 . 得到总 RNA 溶液后用 DNA 酶进行消化 ,去除总 RNA 中的 DNA 杂质 .( )μμ5 取上述纯化后的总 RNA 1L 稀释至 100L ,用紫外分光光度计测定样品的浓度和纯度 . 样品质量浓
μμμ() 度计算公式 : RNA 质量浓度= A×40 /10 g /L . 取 5 g总 RNA
进行电泳鉴定 . 260 [ 5] 2. 3 C TA B溶液提取法
( ) 1 按上述方法收集藻细胞并进行藻细胞的破壁及 RNA 的溶解 .
( ) 2 去除蛋白质和多糖 . 将上述细胞破碎离心后的溶液的上清液分别移
至另一 5 mL离心管中 , 再加入μ 500 L CTAB 溶液于室温下静置 10 m in,每2,3 m in摇动反应管一次 .
( ) () () μ 3 去除 DNA. 加入 V 氯仿 ?V 异戊醇 = 24 ?1 的溶液750 L入试管中 , 剧烈搅拌样品 ; 4 ?下
) () (10 000 r /m in离心 8 m in;小心将上述液相转移到干净的 1. 5 mL
的 Epp endo rf管 ,再加入 V 氯仿 ?V 异戊醇 =
μ 24 ?1的溶液 750 L入试管中 ,剧烈搅拌样品 .
495 第 3期彭喜春 ,等 :两种球形棕囊藻细胞总 RNA 提取方法的比较
( ) 4 RNA 沉淀 . 4 ?下 12 000 r /m in离心 8 m in;小心将液相转移到干
净的 1. 5 mL的 Epp endo rf 管 ; 加入 1 / 3 体积的 8 mo l /L L iC l并剧烈摇匀 , - 20 ?过夜 ; RNA 洗涤及收集 . 4 ?下 12 000 r /m in离心 15 m in,收集 RNA 沉淀 ;用体积分数 70%乙醇清洗沉淀 2次后小心将上层乙醇吸出并打
开盖子在室温下放置几分钟 ,让残存的痕
量乙醇挥发殆尽 ,不要让 RNA 沉淀干透 .
( ) 5 按前述同样方法对 RNA 进行纯化及浓度和纯度的测定 .
3 结果与讨论
μμ用紫外分光光度计所测得的 RNA 质量浓度分别为 111. 2 g /mL和 127.
3 g /mL ,吸光度 A/A分别为 260 280( )( )11910和 11934. 图 1 a和 b分别为试剂盒法和 CTAB 法所获得的总 RNA 电泳图 ,可以看出 a、b两图非常相似 ,其中 18 s rRNA 和 28 s rRNA 比例均约 1 ?115,反映出两种方法均可获得较高质量的总 RNA ,均适用于赤潮藻类总 RNA 的提取 .
CTAB 是一种较强的去污剂 ,对蛋白的变性效 [ 6 ] 果强于 SD S. 同时 , 先用 L iC l 选择性沉淀总
RNA ,然后再用酚 /氯仿抽提使水相中残留的少量
DNA 溶于有机相 , 从而可以去除总 RNA 中的
DNA. 提取缓冲液中高浓度的 N aC l 有利于去除多 [ 3 - 4 ] 糖污染 , L iC l 也可以使部分多糖留在溶液中 [ 7 ] 而不随 RNA 沉淀下来 ,这样极大地降低了沉淀
中多糖的含量 . Q IA GEN 试剂盒法是将硅胶膜技术
与微离心分离柱结合进行分离的 , 一次反应最大
μ只能达到 100 g RNA 的分离量 ,而且 ,具有大量胞
()外多糖的赤潮藻如球形棕囊藻很容易将微离心
柱堵塞 ,降低其提取率 . CTAB 法如果直接加入 016
倍体积异丙醇还可同时得到高质量的基因组
DNA ,降低了实验成本 ; Q IA GEN 试剂盒法不具备
图 1 球形棕囊藻细胞采用两种 RNA 提取法所得的总.这一特点
RNA 电泳结果比较两种方法的提取过程 , 试剂盒法提取
RNA 耗时短 ,整个操作过程不到 1 h;而 CTAB 法提取 RNA 时由于沉淀 RNA 所需要 6 h以上 ,整个操作过程耗时相对较长 ,这是 CTAB 法的缺点 . 但是 ,笔者在提取总 RNA 过程中发现 ,试剂盒法对藻细胞的用量要求非常苛刻 ,样品量
不能超过 100 m g. 即使稍多于 100 m g,也有可能得不到 RNA. 显然 ,要想获得大量总 RNA ,就不得
不多次重复该操作 . CTAB 法对藻细胞的用量要宽松得多 , 同样的试剂量可以提取到 200 m g藻细胞中的总
RNA ,能获得更大量的总 RNA ,适用于大批量 RNA 的提取 . 另外 ,从成本考虑 , Q IA GEN 总 RNA 提取试剂盒( )( ) 20个反应售价约 1 800元 ; CTAB 法所用的主要试剂 CTAB 一瓶 50 g只需 100元 ,可以做大量反应 .
总之 ,用 CTAB 法提取赤潮藻细胞总 RNA 更可取 ,尤其是需要提取大量总RNA 时 . 另外 ,本实验运用核
( )酸提取仪代替研磨对球形棕囊藻 Phaeocystis g lobosa进行破壁 ,简化了破壁操作并有效地防止了研磨时 RNA 酶的污染 ,两种方法均获得了高质量的总RNA.
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[责任编辑 :黄建军 ]。