Ⅱ型Usher综合征或39型视网膜色素变性患者的临床表型、致病基因与新突变位点分析

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引文格式：杨极，邹悦，韦春玲，肖丽波，焦康为．Ⅱ型Ｕ
ｓｈｅｒ综合征或３９型视网膜色素变性患者的临床表型、致病基因与新突变位点分析［Ｊ］．眼科新进展，２０２０，４０（１２）：１１３５ １１３８．ｄｏｉ：１０．１３３８９／ｊ．ｃｎｋｉ．ｒａｏ．２０２０．０２５２
【应用研究】
Ⅱ型Ｕ
ｓｈｅｒ综合征或３９型视网膜色素变性患者的临床表型、致病基因与新突变位点分析△
杨极　邹悦　韦春玲　肖丽波　焦康为
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作者简介：杨极（ＯＲＣＩＤ：００００ ０００３
４７６６ ５４１６
），男，１９９３年７月出生，硕士。

主要研究方向：遗传性视网膜退行性病变细胞死亡机制。

Ｅ
ｍａｉｌ
：８２７８５９１１９＠ｑｑ．ｃｏｍ通信作者：焦康为（ＯＲＣＩＤ：００００ ０００３
３２０２ ５９９３
），男，１９８０年６月出生，博士，主治医师。

主要研究方向：遗传性视网膜退行性病变细胞死亡机
制和玻璃体视网膜疾病。

Ｅ
ｍａｉｌ：Ｋａｎｇｗｅｉ．ｊｉａｏ＠ｗｈｕ．ｅｄｕ．ｃｎ收稿日期：２０２０ ０５ ２８修回日期：２０２０ １０ ０３本文编辑：董建军△
基金项目：国家自然科学基金资助（编号：８１９６０１８０）；云南省应用基
础研究计划项目（编号：
２０１９ＦＢ０９３、２０１８ＦＢ１２３）；云南省科技厅 昆明医科大学应用基础研究联合专项重点项目［编号：２０１８ＦＥ００１（ ００８）］；云南省卫生科技计划项目（编号：２０１７ＮＳ１３０）；云南省科技计划项目
重大科技专项（编号：
２０１８ＺＦ００９）作者单位：６５００００　云南省昆明市，云南省第二人民医院，云南大学附属医院，云南省眼科医院，云南省眼部疾病临床医学研究中心，云南省眼病临床医学中心
【
摘要】　目的　观察Ⅱ型Ｕｓｈｅｒ综合征（ＵＳＨ２）或３９型视网膜色素变性患者的临床表型，分析患者的致病基因与新突变位点。

方法　收集临床诊断为ＵＳＨ２或３９型视网膜色素变
性患者的相关资料和样本，进行全外显子测序，对测序结果进行分析后锁定致病基因与突变位点，并用Ｓａｎｇｅｒ测序验证其突变位点。

结果　本研究共收集５例患者，来自于３个不
同家系，测序数据解读结果显示ＵＳＨ２Ａ基因为５例患者的致病基因，在ＵＳＨ２Ａ基因上共检出３个纯合突变。

先证者１（Ｆ１ Ⅱ１）及其患病的弟弟（Ｆ１ Ⅱ２
）在ＵＳＨ２Ａ基因上均存在ｃ．８２３２Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｗ２７４４Ｃ）（Ｍ１）纯合突变。

先证者２（Ｆ２ Ⅱ１）和其患病的妹妹（Ｆ２ Ⅱ２
）则在ＵＳＨ２Ａ基因上均存在ｃ．８５５９ ２Ａ＞Ｇ（Ｍ２）纯合突变。

先证者３（Ｆ３ Ⅱ１
）在ＵＳＨ２Ａ基因上发现ｃ．１２７７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ４２６０Ｘ）（Ｍ３）纯合突变。

其中所发现的Ｍ３突变为首次报道。

结论　Ｕ
ＳＨ２Ａ基因突变是导致ＵＳＨ２和３９型视网膜色素变性的主要致病原因，ＵＳＨ２Ａ基因突变所致疾病具有典型的遗传异质性和临床异质性，不同的突变所致疾病表型存在差异。

【关键词】　Ⅱ型Ｕｓｈｅｒ综合征；视网膜色素变性；全外显子测序；突变位点【中图分类号】　Ｒ７７４
Ｕｓｈｅｒ综合征（ＵＳＨ）是一类常染色体隐性遗传病，常见的临床表型主要为双眼视网膜色素变性、双侧感音神经性听力损害，一般不伴有前庭功能异
常。

按照疾病临床特点和病程，Ｕｓｈｅｒ综合征可分为３型：Ｉ型（ＵＳＨ１）、Ⅱ型
（ＵＳＨ２）和ＩＩＩ型（ＵＳＨ３）。

目前已发现１６个与Ｕｓｈｅｒ综合征存在明确相关性
的基因［
１］，其中７４％的Ｕｓｈｅｒ综合征为ＵＳＨ２，而３０％～４０％的ＵＳＨ２患者致病原因为ＵＳＨ２Ａ基因突变。

同时，ＵＳＨ２Ａ基因突变也可导致３９型视网膜色
素变性，其在非综合征性视网膜色素变性患者中占比达１０％～１５％［２］。

ＵＳＨ２Ａ基因突变所致疾病具有显著的遗传异质性［３］
，目前报道的ＵＳＨ２Ａ基
因突变已超过６
００种［４］。

本研究我们采用全外显子测序技术对２个ＵＳＨ２家系和１个３９型视网膜色素变性家系进行基因检测，发现３个家系致病原因均为ＵＳＨ２Ａ基因突变，现将结果报告如下。

１　资料与方法
收集２０１８年８月至２０１９年８月就诊于云南省
第二人民医院眼科门诊并确诊为视网膜色素变性的
先证者３例，其中２例先证者伴有听力损害。

详细
询问其家族遗传史，绘制家系图，并募集家族中患有
同样疾病的近亲属参与研究，对参与研究的成员进
行了全面的临床检查，包括：裸眼视力、最佳矫正视
力、裂隙灯下眼前段及眼底检查、眼底照相、眼部
ＯＣＴ检查以及荧光素眼底血管造影检查。

该研究通
过本院医学伦理委员会审核批准，参与研究的患者
均知情并签署知情同意书。

抽取参与研究的家族成员静脉血３～
５ｍＬ，ＥＤ ＴＡ抗凝。

利用基因组ＤＮＡ提取试剂盒按标准操作流程提取外周血全基因组ＤＮＡ。

利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司
定制的基因片段捕获芯片进行靶目标文库富集。

文库采用Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ和ＡＢＩＳｔｅｐＯｎｅ进行片段大小、浓度、富集度的检测。

最后利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｈｉｓｅｑ２０００测序仪进行基因测序。

将原始测序数据转换为ｆａｓｔｑ文件后，使用ＢＷＡ软件将ｒｅａｄｓ比对到人类参考基因组ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９上，生成ｂａｍ文件［５］。

生成的ｂａｍ文件采用ＧＡＴＫ系列软件进行局部重新比对，去除重复序列并进行变异检测［６］。

为锁定可疑致病基因变异，可进行如下分析：（１）筛选检出变异中的非同义突变进行下一步分析；（２）筛选ＥｘＡＣＥＡＳ、ＥｘＡＣＡＬＬ、１０００Ｇｅｎｏｍｅｓ、ｇｎｏ ｍＡＤ等数据库中未见正常人携带或携带率小于５％的变异；（３）参考ｄｂＳＮＰ、ＯＭＩＭ、ＨＧＭＤ、ＣｌｉｎＶａｒ等多种数据库对致病变异位点进行评估；（
４）使用ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ２、ＲＥＶＥＬ等多种蛋白功能预测软件进行基因变异对蛋白功能影响的预测。

根据ＡＣＭＧ（２０１５）
分类指南以及患者的临床表型进行致病变异的筛选。

对于分析结果为致病或可能致病的位点，采用一代Ｓａｎｇｅｒ测序技术进行验证。

采用同源序列多重·
５３１１·眼科新进展　２０２０年１２月　第４０卷　第１２期ＲｅｃＡｄｖＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｏｌ．４０Ｎｏ．１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２０
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｋｘｊｚ．ｃｏｍ
比对，利用ＵＧＥＮＥ软件分析相关突变位点在不同物
种间的保守性［７］。

２　结果　
２．１　患者的临床表现　根据患者的病史、家族遗传
史和临床辅助检测结果，所有的患者眼底检查均表现为视网膜色素变性眼底特点，后极部视网膜可见骨细胞样色素沉积，视网膜血管变细，视盘蜡黄（图１Ａ和图１Ｂ）。

荧光素眼底血管造影检查可见斑驳状透见荧光、色素斑块所致的荧光遮蔽，视网膜血管一致性变细且有荧光渗漏，周边可见，视网膜毛细血
管无灌注所致的充盈缺损（图１
Ｃ和图１Ｄ）。

ＯＣＴ检查可见视网膜变薄，视网膜色素上皮层色素紊乱，感光细胞明显变薄（图１Ｅ和图１Ｆ）。

其中家系１和家系２
中患者同时伴有中等程度的听力损害。

图１　眼底检查结果　Ａ、Ｂ：眼底照相显示，后极部视网
膜骨细胞样色素沉积，视网膜血管变细，视盘蜡黄；Ｃ、Ｄ：荧光素眼底血管造影显示斑驳状透见荧光，可见色素斑块沉积所致的荧光遮蔽，视网膜血管一致性变细且有荧光渗漏，周边可
见，视网膜毛细血管无灌注所致的充盈缺损；
Ｅ、Ｆ：ＯＣＴ检查可见视网膜变薄，视网膜色素上皮层色素紊乱，感光细胞变薄
２．２　患者的基因特点　家系１先证者Ｆ１ ＩＩ１（图
２），男性，诉双眼视力下降伴夜盲、耳聋１２ａ。

家系１先证者患病的弟弟Ｆ１ ＩＩ２，男性，诉双眼夜视力下降１ａ。

２例患者眼底检查均出现典型的视网膜色素变性眼底改变，结合病史和辅助检测，高度怀疑患有ＵＳＨ２。

基因检测结果显示，Ｆ１ ＩＩ１和Ｆ１ ＩＩ２的ＵＳＨ２Ａ基因４２号外显子上均存在ｃ．８２３２Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｗ２７４４Ｃ）（Ｍ１）纯合错义突变（图３Ａ）。

Ｍ１突变Ｐｏｌｙｐｈｅｎ２的ＨｕｍＤｉｖ分值为１．０，ＨｕｍＶａｒ分值为１ ０。

保守性分析显示，ｃ．８２３２Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｗ２７４４Ｃ）所对应氨基酸位点在多物种间高度保守。

３Ｄ蛋白预测模型提示，ｃ．８２３２Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｗ２７４４Ｃ）突变影响蛋白质的局部构像。

ＨＧＭＤ数据库信息收录显示，Ｍ１突变曾在常染色体隐性遗传的ＵＳＨ２患者中被报道，且该突变在正常人群数据库中未见收录。

家系共分离验证结果显示，Ｆ１ Ｉ１和Ｆ１ Ｉ２均携带Ｍ１的杂合突变，Ｆ１ ＩＩ１和Ｆ１ ＩＩ２的Ｍ１纯合突变分别来自
其健康的父母（图３
Ｂ）。

依据ＡＣＭＧ指南的致病性分析，Ｍ１突变满足致病证据ＰＳ１＋ＰＭ２＋ＰＰ，可判断该突变为致病性变异。

结合基因检测结果，最终确诊为ＵＳＨ２。

家系２先证者Ｆ
２ ＩＩ１（男性）和其患病的妹妹Ｆ２ ＩＩ２（图２），均有双眼视力下降伴夜盲、耳聋的病
史。

基因检测结果显示，
Ｆ２ ＩＩ１和Ｆ２ ＩＩ２均于ＵＳＨ２Ａ基因的４２号内含子内存在ｃ．８５５９ ２Ａ＞Ｇ（Ｍ２）纯合剪接突变（图３Ｃ）。

Ｍ２突变为剪接位点
突变，ＨＳＦ剪接突变分析显示，Ｓｉｔｅｂｒｏｋｅｎ变异系数为－
３４．４％，提示该突变可导致受体位点的改变，影响剪接。

保守性分析显示，４３号外显子编码的氨基酸位点２８５３在多物种间高度保守。

ＨＧＭＤ数据库
信息收录显示，
Ｍ２突变曾在ＵＳＨ２患者中被报道，该突变在正常人群数据库中的携带频率为０．０００３，
属于低频突变。

家系共分离验证结果显示，
Ｆ２ Ｉ１和Ｆ２ Ｉ２均携带Ｍ２杂合突变，即Ｆ２ ＩＩ１和Ｆ２ ＩＩ２的Ｍ２纯合突变分别来自其健康的父母。

依据ＡＣＭＧ指南，Ｍ２突变满足证据ＰＶＳ＋ＰＳ１＋ＰＭ２，可判断该突变为
致病性变异。

结合基因检测数据，最终确诊为Ｕ
ＳＨ２。

家系３先证者Ｆ３ ＩＩ１（图２），男性，诉双眼夜视力下降，辅助检查和临床表现提示视网膜色素变性，患
者无听力受损。

基因检测在Ｕ
ＳＨ２Ａ基因上发现ｃ．１２７７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ４２６０Ｘ）（Ｍ３）纯合无义突变（图３Ｄ）。

无义突变可导致蛋白质合成中断，进而影响基
因功能。

该突变在正常人群数据库中未见收录。

Ｈ
Ｇ ＭＤ数据库未收录Ｍ３突变。

依据ＡＣＭＧ指南，Ｍ３满
足证据Ｐ
ＶＳ１＋ＰＭ２，可判断该突变为疑似致病性突变。

由于患者父母已故，未能进行家系共分离验证。

结合基因检测，最终确诊为３
９
型视网膜色素变性。

图２　患者家系图　
箭头所指为先证者
图３　Ｓａｎｇｅｒ测序图　Ａ：家系１先证者Ｆ１ ＩＩ１和患者
Ｆ１ ＩＩ２检测出ＵＳＨ２Ａ基因上存在ｃ．８２３２Ｇ＞Ｃ（ｐ．
Ｗ２７４４Ｃ）（Ｍ１）的纯合错义突变；Ｂ：家系１中Ｆ１ Ｉ１、Ｆ１ Ｉ２检测出ＵＳＨ２Ａ基因上存在ｃ．８２３２Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｗ２７４４Ｃ）（Ｍ１）的杂和错义突变；Ｃ：家系２中先证者Ｆ２ ＩＩ１和患者Ｆ２ ＩＩ２检测出ｃ．８５５９ ２Ａ＞Ｇ（Ｍ２）纯合剪接突变；Ｄ：家系３中先证者Ｆ３ ＩＩ１检出ｃ．１２７７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ４２６０Ｘ）（Ｍ３）纯合无义突变
·６３１１·　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｋｘｊｚ．ｃｏｍ
眼科新进展　２０２０年１２月　第４０卷　第１２期
ＲｅｃＡｄｖＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｏｌ．４０Ｎｏ．１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２０
３　讨论
本研究中３个家系均具有不同的病程及临床症状，家系１和家系２的所有患者眼底检查呈典型的视网膜色素变性改变，同时伴有中度感音神经性耳聋。

家系３中的患者表现为单纯视网膜色素变性，并无耳聋的临床表现。

基因检测结果提示，５例患者的致病基因均为ＵＳＨ２Ａ基因，此基因突变可导致Ⅱ型ＵＳＨ或３９型视网膜色素变性，结合患者临床症状、病程和基因检测结果，家系１和家系２的所有患者均诊断为ＵＳＨ２，家系３中患者诊断为３９型视网膜色素变性。

ＵＳＨ２Ａ基因位于人类常染色体１ｑ４１，由７２个外显子组成，编码ＵＳＨ２Ａ蛋白，此蛋白包括异构体Ａ和异构体Ｂ。

ＵＳＨ２Ａ蛋白异构体Ａ被认为是外分泌蛋白［８］。

异构体Ｂ主要分布于视网膜，除了异构体Ａ的所有组分，还包括２个ＬａｍＧＬ区域、２８个ＦＮ３区域、１个跨膜序列以及１个胞内区，此胞内区Ｃ端有一个ＰＤＺ结合区域［９］。

ＵＳＨ２Ａ蛋白位于光感受器细胞的外周纤毛区，组成ＵＳＨ２蛋白复合体，为外周纤毛和连接纤毛提供结构支持，参与感光细胞的发育和维持感光细胞内节到外节的物质运输［１０］。

目前在ＵＳＨ２Ａ基因上发现的各类突变已超过６００个，包括：错义突变、无义突变、剪接突变和移码突变［１１］。

ＵＳＨ２Ａ基因所致疾病具有高度遗传异质性和临床异质性，即使为同一位点突变，患者的临床表现也不一定相同，部分患者表现为视网膜色素变性，也有部分患者表现为ＵＳＨ２，故对视网膜色素变性和ＵＳＨ２患者进行基因检测明确病因具有重要意义［１２］。

本研究中，我们应用全外显子测序技术对５例患者及其父母进行了基因检测。

通过基因检测发现，在ＵＳＨ２Ａ基因上存在ｃ．８２３２Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｗ２７４４Ｃ）（Ｍ１）、ｃ．８５５９ ２Ａ＞Ｇ（Ｍ２）和ｃ．１２７７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ４２６０Ｘ）（Ｍ３）突变，其中Ｍ３突变为首次报道。

Ｍ１突变在ｄｂＳＮＰ、ＥｘＡＣＢｒｏｗｓｅｒ、ｔｈｅ１０００Ｇｅ ｎｏｍｅｓＰｒｏｊｅｃｔ等数据库中为低频变异。

蛋白同源性序列分析发现突变位点在多物种中均具有高度保守性，同时ＭｕｔａｔｉｏｎＴａｓｔｅｒ、ＳＩＦＴ和Ｐｏｌｙｐｈｅｎ２预测软件分析证实具有致病性。

三维蛋白结构预测模型提示，突变影响了蛋白质的稳定性，可影响蛋白跨膜段，影响ＵＳＨ２Ａ蛋白与膜的整合，影响感光细胞的物质转运。

Ｍ２为纯合剪接突变，保守性分析显示，对应氨基酸片段在多物种间高度保守，剪接突变可导致基因外显子翻译功能受到影响，进而导致ＵＳＨ２Ａ蛋白功能发挥障碍。

Ｍ３为纯合无义突变，该突变使蛋白编码提前终止，进而影响其功能。

由于ＵＳＨ２Ａ基因突变所致疾病具有的高度遗传异质性，目前对其基因型和表现型间关联的了解仍然较少，对于ＵＳＨ２Ａ突变体蛋白在视网膜中所发挥的作用了解依然有限。

在所有已知的ＵＳＨ２致病基因中，ＵＳＨ２Ａ基因是最为常见的致病基因，它所编码蛋白质对感光细胞的发育和功能发挥具有不可替代的作用［１３］，同时ＵＳＨ２Ａ基因突变也可导致３９型视网膜色素变性。

本研究中的三个家系均由ＵＳＨ２Ａ基因突变致病，但临床表型存在差异。

不同的变异位点所致的蛋白合成和翻译变异不同，对蛋白功能影响作用也不尽相同。

因此，对ＵＳＨ２Ａ基因突变的鉴定不仅可以阐明其在ＵＳＨ２和３９型视网膜色素变性发病中的作用，而且有助于临床诊断和寻找治疗疾病的有效方法［１４］。

本研究结果扩大了对ＵＳＨ２Ａ基因突变谱的认知，进一步阐明其致病的分子机制，有利于提高该疾病诊断的准确率［１５］。

参考文献
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ｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅｓｕｐｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＳｃｉ，２００４，１１７
（Ｐｔ２）：２３３ ２４２．
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眼科新进展　２０２０年１２月　第４０卷　第１２期
ＲｅｃＡｄｖＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｏｌ．４０Ｎｏ．１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２０ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｋｘｊｚ．ｃｏｍ
［１３］　ＲＥＩＮＥＲＳＪ，ＮＡＧＥＬ ＷＯＬＦＲＵＭＫ，Ｊ ＲＧＥＮＳＫ，ＭＡＲＫＥＲ
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Ｊ
，ＺＨＵＪ，ＫＩＭＥＪ，ｅｔａｌ．ＩｎｖｉｖｏｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｖｉａＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｍｅｄｉａｔｅｄｈｏｍｏｌｏｇｙ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔａｒｇｅｔｅｄｉｎ ｔｅｇｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５４０（７６３１）：１４４ １４９．
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ＫＩＭＢＥＲＬＩＮＧＷＪ，ＬＥＷＩＳＲＡ，ｅｔａｌ．ＣｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｔｈｅＵｓｈｅｒｓｙｎｄｒｏｍｅｓ［Ｊ］．ＡｍＪＭｅｄＧｅｎｅｔ，１９９４，５０（１）：３２ ３８．
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眼科新进展　２０２０年１２月　第４０卷　第１２期
ＲｅｃＡｄｖＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｏｌ．４０Ｎｏ．１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２０。