miRNA 在基因表达调控中的作用

注意事项: 1,通过RNA聚合酶II转录生成.具有mRNA的结构特征 2,可以是多顺反子结构.即一条pri-miRNA包含多个成熟 miRNA的信息.
3,在判断一非编码蛋白质的mRNA是否生成miRNA时,我们可 以通过抑制Drosha的活性,观察pri-miRNA的含量是否增加. 4,miRNA可来源于外显子,也可来源于内含子和非编码序列.
Micro RNA在基因表达调控中的作用
一.怎样定义miRNA(成熟)
1, 长度为22nt的转录体.可通过northern blot等方法检测得 到. 2,其前体为典型的发卡结构.miRNA位于发卡结构的茎部分. .
3, 通过Dicer酶的处理后生成.
4,序列具有高度的保守性.
二.miRNA的生成过程
注意事项: 根据背景知识, 选择两个或两个以上网站均有预测的靶 基因做进一步分析
七．怎样证实miRNA的靶基因
5’UTR
靶基因mRNA
ORF
3’UTR
AAAAAAAAA PCR扩增3’UTR
克隆3’UTR到报告基因 luciferase下游 luciferase 3’UTR
报告载体
将重组载体转染细胞,观察过表达或抑制miRNA 后,luciferase活性是否改变.

5.miRNA在基因组DNA上成族分布,处于同一族的miRNA常共 表达
6. 对于同一家族miRNA,其功能常具有互补作用. 比如: 在MYC诱导的B细胞淋巴瘤小鼠模型中,剔除miR-17-92 族DNA序列可诱导凋亡,如果导入此族中的任意一种miRNA均 可减轻细胞凋亡. 7. 不同miRNA可同时调节同一靶mRNA 三. miRNA 的作用机制及功能 作用机制:与靶基因mRNA 3-非翻译区通过不完全配对结合降低mRNA稳 定性或抑制靶基因的 翻译.此外, miRNA也可与5-非翻译区和编码区序列 结合调节靶基因的表达. 有文献报道,miRNA可与mRNA3-非翻译区的其他 部位结合,升高mRNA的稳定性. 注意事项: 1, 由于miRNA与靶序列是通过不完全配对结合,因此证实 miRNA的靶基因成为一难点. 2,一种miRNA常有多个靶基因. 功能: miRNA 主要通过抑制它的靶基因来起调控作用。miRNA 的作用 遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的过程。 Lewis 等人的预 测结果发现，预测的 miRNA 的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿 瘤发生的基因。虽然 miRNA 的作用也是特异的，特别是5'端的2～8个 碱基，特异性的靶向与它的靶基因，但是与 siRNA 不同的 是 miRNA 的特异性并不是那么强，在生物体内往往一个 miRNA 作用 于多个靶基因
第二种方法: 由生物信息学预测miRNA的靶基因.预测miRNA靶 基因的网站:
/mammalian/index.html.
/ /microrna/home.do /
为进一步证实miRNA确实调节该靶基因,还需完成以 下实验
1,突变3’UTR 上与 miRNA结合序列(主 要是种子序列),观察 突变后的3’UTR 可否 废除miRNA对 luciferase活性的影 响
2,观察过表达或 抑制miRNA后,内 源性靶基因 mRNA和蛋白质 水平是否相应改 变.
3,miRNA与靶基因 功能相关性的研究
抑制cytokine signaling
四.microRNA表达的特点
1,时间特异性 在高等生物,microRNA的表达在生长发育的不同阶段是不同 的..
2,组织特异性 在不同的组织中, microRNA的表达不同的
四.寻找 miRNA 基因
1. Forward genetics
2. MiRNA cloning
putational approaches to miRNA discovery
五.检测 miRNA 表达的方法 1, Northern 杂交 2, Real-time RT-PCR
3. 基因芯片的方法
六．怎样预测miRNA的靶基因 第一种方法: 过表达或抑制miRNA的表达,利用基因芯片筛选出差异表达基因.从 这些差异表达的基因中,证实miRNA的靶基因.
1.miRNA与细胞增殖
2.miRNA与细胞凋亡
3.miRNA与细胞信号传导
Proinflammatory cytokine
Stress(H2O2,UV等)
转录因子p53
转录因子NF-kB
miR-34a
miR-146
apoptosis
(1) IL-1 receptor- associated kinase 1 (2) TNF receptor- associated factor 6
八. miRNA表达调控与肿瘤
1. miRNA在基因组DNA上拷贝数的改变(扩增,转位和缺失) 比如: (1) 在B-CLL中, miR-15a/16-1族区域DNA出现缺失. (2) 在淋巴瘤细胞中, miR-17-92族区域DNA出现扩增. 在胶质细胞瘤中, miR-26a出现扩增 (3) 在T-ALL中, miR-17-92出现转位.
5. miRNA与肿瘤的诊断
谢谢大家!!
注意事项: 1.并非所有的差异表达基因都是miRNA的靶基因.许多差异基因表达 的改变是由靶基因表达的改变而引起.
miRNA P53的靶基因不是该miRNA的靶基因
转录因子p53
P53的靶基因
2.该方法不能证实miRNA所有的靶基因.根据miRNA与靶基因mRNA 3’UTR的配对程度不同, miRNA可降解靶基因mRNA(配对程度高),也可不 降解靶基因mRNA (配对程度低) 但抑制mRNA的翻译,
2. miRNA合成的影响
3. miRNA的转录调控 (1)转录因子对miRNA的调节作用.
(2)DNA甲基化对miRNA的调节作用.
比如: miR-136,-431,-432,-433. (3)表观遗传对miRNA的调节作用.
4.miRNA与肿瘤的转移 比如: miR-10b,miR-9,miR-31 and miR-335与乳腺癌的转移有关