丝状真菌发酵小麦麸皮中酚类物质抑制胰脂肪酶活性和HepG2细胞内甘油三酯沉积的作用

丝状真菌发酵小麦麸皮中酚类物质抑制胰脂肪酶活性和
HepG2细胞内甘油三酯沉积的作用
王春丽;黄士淇;孙丹;蔡圣宝
【摘要】探讨了2种食品加工中常用的丝状真菌(米根霉和米曲霉)固态发酵小麦麸皮后,其总酚含量的变化,研究了发酵前后小麦麸皮中酚类物质对脂肪酶活性和HepG2细胞内甘油三酯沉积的抑制作用.结果表明:发酵能显著提高小麦麸皮的总酚以及其抗氧化性(P＜0.05).发酵后的小麦麸皮酚类物质抑制胰脂肪酶以及HepG2细胞内甘油三酯沉积的活性均显著增强(P＜0.05).未发酵、米根霉和米曲霉发酵的小麦麸皮乙酸乙酯萃取物抑制胰脂肪酶活性的IC50值分别是1.35、0.78和0.85 mg/mL.在90μg/mL质量浓度条件下,未发酵、米根霉发酵和米曲霉发酵小麦麸皮的乙酸乙酯组分对HepG2细胞内甘油三酯沉积的抑制率分别为
14.4％,26.2％和20.5％.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2016(042)003
【总页数】6页(P61-66)
【关键词】小麦麸皮;发酵;酚类物质;胰脂肪酶;甘油三酯
【作者】王春丽;黄士淇;孙丹;蔡圣宝
【作者单位】昆明理工大学化学工程学院,云南昆明,650500;昆明理工大学云南省食品安全研究院,云南昆明,650500;昆明理工大学云南省食品安全研究院,云南昆明,650500;昆明理工大学云南省食品安全研究院,云南昆明,650500
【正文语种】中文
非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种最常见的慢性肝病，其定义为：在没有过度饮酒和其他特定病因的情况下，肝细胞中出现甘油三酯(triglyceride, TG)的过度累积[1]。

现如今，NAFLD已经成为严重威胁人类健康的疾病，在中国约有15%的人有NAFLD，而在西方国家，这一比例高达20%～40%，并且这一疾病的发病率还在快速地增加[2-3]。

因此，如何有效地预防和治疗NAFLD一直是一个研究的热点。

在过去几十年里，研究者们在预防和治疗NAFLD领域做了大量工作。

根据NAFLD的发病机理，当肝细胞中TG过度累积后，肝细胞更容易受到损伤，发展成为非酒精性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)[4]。

因此，降低肝细胞中TG的累积被认为是预防NAFLD的一个有效手段，这一目的可以通过抑制肝细胞对游离脂肪酸(free fatty acids, FFAs)的吸收以及TG的合成来达到。

前人研究发现，许多植物性食物中的生物活性物质可以有效预防肝脏中TG的累积[5-7]。

而在这些活性物质中，酚类物质引起了广泛的兴趣。

研究发现，酚类物质不但能够通过抑制胰脂肪酶活性来降低FFAs的吸收[8-9]，而且还可以促进肝细胞对FFAs的氧化消耗[5], 从而最终降低肝细胞中TG的累积，预防NAFLD。

小麦麸皮是小麦种子的外层结构，是一种常见的农业废弃物，富含酚类物质[10-11]。

但是谷物麸皮中的大部分酚类物质与脂肪酸、糖、蛋白质或者其他大分子物质形成结合物，这些结合状态的酚类物质较难被人体吸收利用[12-13]。

因此，需要采用水解等方式将酚类物质从麸皮中释放出来。

微生物固态发酵一直以来被用于食品的加工制作。

这些微生物，特别是丝状真菌，在发酵过程中可以产生多种不同的水解酶，从而可以将植物性食物中的结合态酚类物质释放出来。

大量前人研究报道了固态发酵可以提升黑豆[14]，小麦[12]，燕麦[15]和大米[16]的酚类物质和抗氧化能力。

另外，有研究表明，固态发酵燕麦可以提高燕麦酚类物质提取物抑制胰
脂肪酶的作用[9]。

然而，关于丝状真菌发酵小麦麸皮的酚类物质含量，抗氧化性，抑制胰脂肪酶和抑制肝细胞中TG累积的研究却未见报道。

因此，本研究的目的是探讨经两种食品加工常用丝状真菌发酵后的小麦麸皮中酚类物质含量，抗氧化性，抑制胰脂肪酶和抑制HepG2细胞中TG累积活性的变化。

1.1 材料与试剂
荧光素钠盐，Trolox，偶氮二异丁脒盐酸盐(2,2-azobis-2-methylpropion-amidine dihydrochloride, AAPH)，2型猪胰脂肪酶195 U/g，油酸(oleic acid, OA)，牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)和对硝基苯月桂酸酯购自Sigma-Aldrich公司(中国，上海)。

胎
牛血清(foetal bovine serum, FBS)，青霉素-链霉素双抗和DMEM培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium, DMEM)购自Gibco公司(中国，北京)。

福林酚反应试剂购自Merck公司(中国，北京)。

两株丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae，2064)和米根霉(Rhizopus oryzae，40282) 购自中国工业
微生物菌种保藏管理中心。

真菌接种到PDA培养基上后，在30 ℃条件下培养5 d，使其长出孢子，然后用0.9% NaCl 生理盐水洗下孢子制备成孢子悬液。

1.2 小麦麸皮发酵及提取物制备
小麦麸皮购自当地面粉加工厂。

发酵方法参考文献报道并稍加修改[9,15]。

小麦麸皮(50 g)装入500 mL锥形瓶中，然后121 ℃灭菌15 min，冷却至室温后，每瓶样品中加入孢子悬液(1×106个孢子/g小麦麸皮)和25 mL灭菌的生理盐水。

然后，所有样品在30 ℃下培养4 d，并且每隔12 h充分摇晃1次。

不加孢子悬液的一
组样品作为对照组。

提取物的制备方法参考文献报道[15]。

所有小麦麸皮样品用体积分数为80%的乙
醇在45 ℃条件下超声提取30 min，然后离心10 min (离心力3 000 g)。

收集上
清后，利用相同条件对其沉淀再提取1次，合并每个样品的上清。

所有样品的上
清溶液在45 ℃ 条件下减压旋转蒸发浓缩成乙醇提取物。

然后再用80%甲醇将这
些提取物复溶，依次用石油醚，乙酸乙酯，水饱和正丁醇进行液液萃取。

去除有机试剂，所有样品冻干后储存于-80 ℃。

1.3 总酚含量测定
本研究采用Folin-Ciocalteu法测定每个样品的总酚含量并稍加修改[17]。

具体操作为：经过适当稀释的样品(1.0 mL)与Folin-Ciocalteu试剂(1.0 mL)进行充分混合。

然后依次加入1.5 mL的200 g/L的Na2CO3溶液和7.5 mL蒸馏水，充分混合后在70 ℃水浴中反应10 min。

当反应液冷却至室温后，在765 nm条件下测
定每个反应液的吸光值。

样品中总酚含量表示为1 g提取物中含有的没食子酸质
量(mg)，每个样品重复3次。

1.4 抗氧化能力指数(ORAC法)
参照前人报道的ORAC法[15]测定所有样品的抗氧化能力。

实验在黑色96-微孔
板(Nunc, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark)上进行。

具体操作如下：首先用磷酸缓冲液(75 mmol/L, pH 7.4)配制荧光素钠盐溶液(7.98×10-4 mmol/L)和AAPH溶液(173 mmol/L)。

然后取100 μL荧光素钠盐溶液加入到25 μL 适当浓度的样品中，混合均匀后于37 ℃下孵育10 min。

然后加入75 μL之前配制好
的AAPH溶液，从而启动反应。

利用多功能微孔读板器(SpetraMax M5, Molecular Device)每隔2 min读取荧光值(485 nm激发波长，515 nm发射波长)，共读取2 h。

实验结果表示为：μmol trolox/g提取物。

1.5 胰脂肪酶活性抑制实验
胰脂肪酶活性抑制实验方法参照文献并稍加修改[9]。

首先将胰脂肪酶溶解于超纯
水中，使其质量浓度为5 mg蛋白/mL，然后在10 000 g 离心力下离心5 min后，取其上清供后续实验使用。

实验中，反应缓冲液采用Tris-HCl (100 mmol/L, pH
8.2)。

将对硝基苯月桂酸酯溶于乙酸钠缓冲液(5 mmol/L, pH 5.0，并含有体积分
数为1%的Triton X- 100)中制成1.0 g/L的反应底物储备液。

取100 μL溶于DMSO中的提取物，加入到250 μL的反应底物和500 μL 反应缓冲液中。

充分混匀后，加入150 μL胰脂肪酶启动反应，将反应液放于37 ℃条件下反应120 min。

反应结束后，所有反应样品在10 000 g下离心60 s，然后在400 nm 波长下测定上清的吸光值(OD)。

按公式(1)计算胰脂肪酶抑制率：
胰脂肪酶抑制率
1.6 细胞培养和细胞毒性实验
HepG2细胞购自中国科学院昆明动物所细胞库。

细胞用含有体积分数为10%的胎牛血清(FBS)和体积分数为1%的双抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素)的DMEM培养基在5% CO2培养箱中于37 ℃下培养。

每2天换1次细胞培养液DMEM。

采用稍加修改的MTT法对所有测试样品和油酸(OA)的HepG2细胞毒性经行检测[18]。

将HepG2细胞接种于24孔板培养24 h后(1×104/孔)，加入含有测试样
品或者OA的新鲜DMEM培养基继续培养24 h。

培养结束后去除培养基，用PBS缓冲液将细胞清洗1遍，然后每孔加入150 μL含有0.5 mg/mL MTT的不完全DMEM培养基继续培养4 h。

然后将培养基去除干净，再加入150 μL DMSO 溶解细胞内形成的甲瓒。

充分溶解后，利用多功能微孔读板器(SpetraMax M5, Molecular Devices)在570 nm 测定每孔的吸光值。

结果表明本研究中所采用的
样品浓度和油酸浓度均对HepG2细胞没有毒性。

1.7 HepG2内甘油三酯(TG)的测定
参照前人的研究报道构建HepG2 细胞内TG累积模型[7,19]。

首先将HepG2细
胞(1×104/孔)接入24-孔板并培养24 h。

然后将培养孔内的培养基更换为含有
0.7 mmol/L 油酸-牛血清白蛋白(OA-BSA) 复合物(摩尔比, OA∶BSA=4∶1)和样
品。

只含有OA-BSA复合物的组为模型组，只含有牛血清白蛋白的组为对照组。

培养24 h后，移除培养基并清洗干净后，将每孔内HepG2细胞裂解用于测定细胞内的TG含量。

样品对细胞内TG累积的抑制率按公式(2)计算：
TG抑制率
1.8 统计分析
所有试验均重复测定3次，数据表示为平均值(n=3)± 标准偏差(SD)，并通过单因素方差分析(one-way ANOVA)对所有数据进行显著性分析，P< 0.05认为具有显著性差异(Tukey检测)，所有数据均采用Origin 8.5软件进行统计学分析并作图。

2.1 各样品中总酚含量(TPC)
小麦麸皮中所含的酚类物质具有很好的生理活性。

但是，麸皮中的很多酚类物质都是和大分子物质酯化，以不可溶状态存在。

之前大量研究表明，丝状真菌固态发酵可以将植物中的结合态酚类物质水解出来[12, 15]。

本研究中所使用的米曲霉和米根霉通常认为是安全的，并且在亚洲常被用来进行发酵食品的加工，这两种丝状真菌在发酵过程中可以产生多种酶，从而可以将酯化的营养物质水解释放出来[15]。

这两种真菌发酵后小麦麸皮不同提取物的总酚含量结果见图1。

如图1所示，对于米根霉发酵的小麦麸皮来说，除了石油醚萃取组分外(P> 0.05)，其他3个组分的
总酚含量都显著增加(P< 0.05)。

而对于米曲霉发酵的小麦麸皮不同萃取物来说，
其正丁醇和乙酸乙酯萃取物组分的总酚含量也显著升高(P< 0.05)。

另外，不论小
麦麸皮发酵与否，4个组分中，乙酸乙酯萃取物组分的总酚含量最高(P< 0.05)。

相对于未发酵的小麦麸皮乙酸乙酯萃取物组分，米根霉和米曲霉发酵的小麦麸皮乙酸乙酯萃取物组分的总酚含量分别上升大约2.6倍和1.7倍。

2.2 各样品的抗氧化能力
采用ORAC法测得的各样品抗氧化能力结果如图2所示，抗氧化能力表示为
μmoL trolox/g 提取物。

从图2可以看出，不论是发酵还是未发酵小麦麸皮，其
乙酸乙酯组分的抗氧化能力是最强的，具有最高的ORAC值(P< 0.05)，其次是正丁醇和水相组分，但是，石油醚组分抗氧化能力最低(P< 0.05)。

食品原料中很多
天然化合物具有抗氧化性，在这些天然成分中，酚类物质，尤其是多酚类化合物，不但含量丰富，而且抗氧化能力强[20-23]。

已有研究表明谷物中也含有丰富的酚
类物质，主要集中的谷物的麸皮中，是谷物抗氧化性的主要活性物质[24-25]。

本
研究也发现，样品总酚含量和ORAC值之间具有显著的正相关关系(r=0.985,
P<0.01)，这表明酚类物质也是小麦麸皮中主要的抗氧化性物质。

2.3 各样品对胰脂肪酶活性的抑制效果
在胃肠道中，甘油三酯被水解成甘油和游离脂肪酸后被身体吸收，而在这一生化过程中，胰脂肪酶起着关键的作用，大约70%的甘油三酯是需要胰脂肪酶来进行水
解[26]。

因此，抑制胰脂肪酶活性作为预防和治疗非酒精性脂肪肝和肥胖症的一个措施和靶点已经被广泛研究。

前人的许多研究表明多种酚类化合物具有很好的胰脂肪酶抑制活性[8-9]。

根据预实验结果，本研究测定了在1.0 mg/mL下每个萃取组分对胰脂肪酶活性的抑制作用，结果见图3。

如图3所示，不论发酵与否，乙酸乙酯组分对胰脂肪酶活性的抑制作用最强(P< 0.05)，其次是正丁醇组分。

但是，石油醚组分和水相组分
抑制作用最弱，且彼此之间没有统计学显著差异(P> 0.05)。

两株丝状真菌固态发
酵均能显著提高小麦麸皮萃取物对胰脂肪酶的抑制作用，尤其是乙酸乙酯萃取组分(P< 0.05)。

对于米根霉发酵小麦麸皮的乙酸乙酯萃取组分来说，其抑制作用比未
发酵小麦麸皮的乙酸乙酯组分的抑制作用增强了2倍。

对于米曲霉发酵小麦麸皮
的乙酸乙酯组分来说，其抑制作用提高了大约1.7倍(图3)。

为了获得乙酸乙酯组
分抑制胰脂肪酶的IC50值，测定了不同浓度乙酸乙酯组分对胰脂肪酶的抑制作用，结果如图4所示。

不论发酵与否，乙酸乙酯组分对胰脂肪酶的抑制作用呈现剂量
依赖关系。

对于未发酵、米根霉发酵和米曲霉发酵的小麦麸皮乙酸乙酯组分来说，
抑制胰脂肪酶作用的IC50值分别为1.35, 0.78和0.85 mg/mL，发酵样品的
IC50显著低于未发酵样品(P< 0.05)。

通过分析发现，样品总酚含量和对胰脂肪酶抑制作用呈显著的正相关关系(r =
0.937, P< 0.01)，这个表明不论发酵与否，小麦麸皮中的酚类物质是其抑制胰脂
肪酶的主要物质。

食物中酚类物质抑制胰脂肪酶的作用已经被广泛研究。

GONDOIN等人体外研究表明绿茶和白茶中的酚类物质能显著抑制脂肪酶活性，
尤其是其中的STRICTININ[8]。

MORENO等人也发现富含咖啡酸、阿魏酸和苯甲酸的花生壳提取物在体外能抑制胰脂肪酶的活性[27]。

葡萄籽富含多种酚类物质，研究也发现葡萄籽提取物具有抑制胰脂肪酶活[28]。

2.4 各样品抑制HepG2细胞内甘油三酯累积的作用
根据前人的研究和当前实验的结果，发酵和未发酵小麦麸皮的富含酚类物质组分(乙酸乙酯组分)被用来测试其抑制肝细胞TG累积的作用。

因此，首先测定了各样
品和油酸的细胞毒性。

根据测得的结果表明，当样品质量浓度为90 μg/mL和油
酸浓度为0.7 mmol/L时对HepG2细胞均没有表现出毒性。

所以在本研究中，样品质量浓度选为90 μg/mL；并用0.7 mmol/L油酸进行造模。

如图5所示，未发酵小麦麸皮的乙酸乙酯组分具有较好的抑制甘油三酯沉积作用，在90 μg/mL 时，其抑制率为14.4%。

而发酵后的小麦麸皮乙酸乙酯组分对甘油酸酯的抑制率显著
提高(P< 0.05)。

米根霉和米曲霉发酵小麦麸皮乙酸乙酯组分对甘油酸酯的抑制率
分别为26.2%和20.5%。

大量前人研究也表明，富含酚类物质的提取物在体内或
体外实验中，都表现出较好的抑制TG累积的作用，如绿茶提取物、蓝莓提取物、黑米提取物等等[5,29,30]。

本项研究结果表明，小麦麸皮乙酸乙酯提取物不但具有较好的抗氧化性，还能显著抑制胰脂肪酶活性，清除HepG2细胞内甘油三酯的累积。

而且，用米根霉和米曲霉固态发酵都能显著提升小麦麸皮的上述三种生物活性。

因此，发酵后的小麦麸皮
可能在预防肝细胞脂肪变性方面具有一定的应用价值，可以作为一种健康促进成分添加到日常的膳食中。

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