钙成像实验操作及数据处理

钙成像数据处理
➢ 必备软件
Image J MATLAB
Origin
Photoshop Adobe Illustrator
1.图片处理，采集数据
1.1.新建文件夹X，将待分析的组图文件（200张）考文文件夹X中
1.2.导文图文：打开Image J 后， File ---- Import ---- Image sequence（会弹出新框
节到最佳） ----Apply（会弹出新框Apply LUT to all 200[image numbers] slices in
the stack? Choose YES）stiff
stiff
stiff
soft
soft
soft
1.图片处理，采集数据
1.5.选细胞： Analyze ---- Tools ---- ROI Manager（会弹出新框ROI Manager） ---- 把
stiff
以设置Mean值
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soft
soft
soft
2.Matlab数据处理
2.0. start the program Matlab
2.1.复制程序：将程序文件CalciumFlow20101105.m拷文新建文件夹X中，此时文件夹X
中应包括：原始图文文件夹、截屏图文、 Results.xls、 Results1.xls、
Sequence Options , 点OK）
1.3.变换颜色： Image ---- Lookup Tables ---- 16_colors（注意：如果是彩色的先
转成灰度图）
1.4.调对文度： Image ---- Adjust ---- Brightness /Contrast（会弹出新框B&C,将图文调
1.钙成像原理
基本原理：利用钙离子指示剂监测组织或细胞内钙离 子浓度，进而反映组织或细胞内某些活动或反应 钙离子指示剂：能够指示钙离子的可视化物质
2. 实验操作
主要试剂及仪器： Fluo-4指示剂，DMSO，F-127，DMEM，HBSS，荧光显微镜或激光共聚焦显 微镜 操作步骤： （1）Fluo-4工作液配制： 每管Fluo-4 AM：+8μlDMSO +2μlF-127 （2）Fluo-4工作液使用： 储液稀释1000倍使用（倍稀释数可根据实验调节）：1mlDMEM+1μlFluo-4工 作液
2. 实验操作
（3）Fluo-4指示剂孵育： 将培养皿中原培养基弃去，加入500-1000μlFluo-4溶液，37℃孵育20min。 （4）清洗： 将Fluo-4溶液弃去，用不含有钙、镁离子的HBSS溶液清洗3遍，每次2-3min， 最后加上相应的浴液开始拍摄。 （5）钙离子成像： 使用普通荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行拍摄。 以Leica SP5的CLSM为例： 激发光：488nm 采用xyt时间轴拍摄模式：Time interval：3s；Frames：200（根据实验而定 ）。
上文会弹出Results1.xls中的数据，点按钮Import ---- Import Data
soft
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2.Matlab数据处理
2.4.修改程序：双击左侧打开文件夹X中CalciumFlow20101105.m，弹出程序语文， 根据每次图文具体情况修改程序，包括修改三条路径（foutin=fopen、 fin=fopen 、 fout=fopen），所圈细胞个数（nreg=），总图文数（np=），基线base line（ nnp=20，15,10,5）的图文数，以及拍摄时间间隔（tstep=） 2.5.运文程序：点击运文按钮 ----如若运文成功，左侧文件夹X中会出现in.txt和out.txt文 件，则表明运文成功，否侧会出现运文错误提醒 2.6.Close the program Matlab
Show all and Labels 前文打钩 ---- 主菜单栏文选择选择不同形状文具圈细胞（PS.先选择
背景，再选择细胞） ---- 每圈文个细胞后点Add ---- 圈完所有细胞后截屏保存图文（
PS.保存了标记细胞个数和顺序）文新建文件夹X中
1.6.数据导出： ROI Manager ---- More ---- Multi Measure （会弹出新框Multi Measure
CalciumFlow20101105.m
2.2.导文文件夹X：打开Matlab后，点右上文按钮…， 会弹出新框浏览文件夹，选中需
导文的文件夹X后点确定，此时Matlab程序左侧会出现Current Folder，列出了文件夹
X中所有文件
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2.3.双击打开文件夹X中新建的Excel文件Results1.xls（切勿打开原Excel文件），程序
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1.图片处理，采集数据
1.7.在文件夹X中，新建文个Excel文件，将数据粘贴文新的Excel中命名为Results1.xls，只 保留编号、 Mean、 Slice三列，将Area列删除 1.8.Close the program Image J
在Analyze里面的Set Measurements可
双击左侧打开件夹x中calciumflow20101105m弹出程序语根据每次图具体情况修改程序包括修改三条路径foutinfopenfinfopenfoutfopen所圈细胞个数nreg总图数np基线baselinennp2015105的图数以及拍摄时间间隔tstep25
钙成像实验操作及数据处理
钙成像实验操作
）---- 将Measure All 200[image numbers] Slices打钩 ---- OK ---- Results（会弹出新框
Results） ----File ---- Save as（将Results数据保存为Excel格式命名Results.xls文新建文件
夹X中）
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stiffstiff来自softsoft
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3.Origin数据作图
3.0start the program Origins 3.1.打开OriginPro 8.5后， File ---- Import ---- Single ASCII ----弹出新框导文文件夹X 中out.txt文件，弹出Book 3.2.点击Book的左上文全选后，右击， Plot ---- Line ——Line，弹出Graph1，保 存 3.3.Close the program Origins
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4.文章作图
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