miR-150 缺失通过细胞免疫应答促进玉型糖尿病的发生

doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2020.22.002
miR⁃150缺失通过细胞免疫应答促进Ⅰ型糖尿病的发生①
高丽清　梁　靖　张　爽　李钰锐　李洁心　刘　潇　刘美丽　段一硕　赵亚林　张　琦　李晓晓　张　冰②　王勇满③　李秋飞④　郑全辉　(华北理工大学基础医学院,河北省慢性疾病重点实验室,唐山市慢性病临床
基础研究重点实验室,唐山063210)
中图分类号　R392 文献标志码　A 文章编号　1000⁃484X (2020)22⁃2693⁃05
①本文受国家自然科学基金面上项目(81373111,81673208)和河北省卫生和计划生育委员会科研基金项目(20190105)资助㊂②河北医科大学第三医院,石家庄050051㊂③唐山市人民医院医疗集团,唐山063000㊂④唐山市丰南区医院,唐山063000㊂
作者简介:高丽清,女,硕士,初级检验师,主要从事免疫调节性T 细胞的发育与功能方面的研究,E⁃mail:304390647@㊂通讯作者及指导教师:郑全辉,男,博士,教授,主要从事免疫调节性T 细胞的发育与功能方面的研究,E⁃mail:1078209929@㊂
[摘　要]　目的:探讨miR⁃150缺失对链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠Ⅰ型糖尿病(T1DM)发生的影响及其免疫学机制㊂方法:将小鼠分为miR⁃150基因敲除组(150KO)及其野生型正常对照,利用STZ 体内注射诱导T1DM㊂ELISA 检测糖尿病相关自身抗体变化;流式细胞术检测小鼠脾脏CD4+T 细胞㊁CD8+T 细胞㊁B 细胞以及调节性T 细胞(Treg)比率变化,采用细胞内染色检测CD4+T 细胞IFN⁃γ㊁IL⁃4和IL⁃17表达变化㊂结果:miR⁃150缺失可显著加速STZ 诱导的小鼠T1DM 发生㊂与WT 小鼠相比,150KO 小鼠血清糖尿病相关自身抗体水平显著升高,但STZ 处理只显著提高了WT 小鼠糖尿病相关自身抗体水平,对
150KO 小鼠抗体水平没有影响㊂与STZ 处理的WT 小鼠相比,STZ 处理的150KO 小鼠脾脏CD4+T 细胞㊁CD8+T 细胞和B 细胞比率差异无统计学意义,但Treg 比率显著降低㊂STZ 处理的150KO 小鼠CD4+T 细胞中IFN⁃γ和IL⁃17表达阳性率与WT 小鼠相比显著提高,但IL⁃4表达阳性率变化无统计学意义㊂结论:miR⁃150缺失不影响STZ 处理小鼠糖尿病相关自身抗体变化,但会导致Treg 减少,CD4+T 细胞中IFN⁃γ和IL⁃17表达上升,说明miR⁃150缺失主要通过细胞免疫应答加速小鼠T1DM 发生㊂
[关键词]　Ⅰ型糖尿病;miR⁃150;自身抗体;调节性T 细胞;IFN⁃γ;IL⁃17
miR⁃150deletion accelerates T1DM by disordering cellular immunity
GAO Li⁃Qing ,LIANG Jing ,ZHANG Shuang ,LI Yu⁃Rui ,LI Jie⁃Xin ,LIU Xiao ,LIU Mei⁃Li ,DUAN Yi⁃Shuo ,ZHAO Ya⁃Lin ,ZHANG Qi ,LI Xiao⁃Xiao ,ZHANG Bing ,WANG Yong⁃Man ,LI Qiu⁃Fei ,ZHENG Quan⁃Hui .School of Basic Medical Sciences ,North China University of Science and Technology ,Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases ,Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases ,Tangshan 063210,China
[Abstract ]　Objective :To investigate effect of miR⁃150deletion on occurrence of type I diabetes mellitus(T1DM)in mice and
its immunological mechanism.Methods :Mice were divided into miR⁃150knockout(150KO)and wild⁃type normal control group(WT),and T1DM was induced by streptozotocin (STZ)injected.Changes in serum diabetes⁃related autoantibodies were detected by ELISA,and changes in ratios of CD4+T cells,CD8+T cells,B cells and regulatory T cells (Treg)in the spleen of mice were detected by flow cytometry.Expressions of IFN⁃γ,IL⁃4and IL⁃17in CD4+T cells were detected by intracellular staining.Results :miR⁃150deletion sig⁃nificantly accelerated the occurrence of STZ⁃induced T1DM in pared with WT mice,serum level of diabetic autoantibodies in 150KO mice were significantly increased,while STZ treatment only significantly increased level of autoantibodies in WT mice,but had no effect on level of antibodies in 150KO pared with WT mice treated with STZ,ratio of CD4+T cells,CD8+T cells and B cells in spleen of 150KO mice treated with STZ were not significantly change,but ratio of Treg was significantly reduced.Positive expression rates of IFN⁃γand IL⁃17in CD4+T cells of 150KO mice treated with STZ were significantly increased compared with WT mice,but positive rates of IL⁃4were not significantly changed.Conclusion :miR⁃150deletion did not affect changes of diabetic autoantibodies in
STZ⁃treated mice,but it led to decreased Treg and increased expressions of IFN⁃γand IL⁃17in CD4+T cells,indicating that miR⁃150deletion mainly accelerated the occurrence of T1DM in mice through cellular immune response.
[Key words ]　T1DM;miR⁃150;Autoantibody;Treg;IFN⁃γ;IL⁃17
㊃
3962㊃高丽清等　miR⁃150缺失通过细胞免疫应答促进Ⅰ型糖尿病的发生　第22期
目前研究表明,Ⅰ型糖尿病(typeⅠdiabetes mellitus,T1DM)是由于机体免疫自稳功能失常导致的一类自身免疫性疾病,由抗体介导的体液免疫应答和效应T细胞介导的细胞免疫应答对胰岛β细胞的攻击是T1DM发病的重要原因[1,2]㊂microRNAs是一类具有负向基因表达调节功能的短链非编码RNA (约22个核苷酸),在机体多种免疫细胞的发育㊁分化和功能发挥中具有重要调控作用[3]㊂miR⁃150在淋巴细胞中高表达㊂已有研究表明,miR⁃150在T1DM 患者血清/血浆㊁外周血单个核细胞和胰岛等组织中表达降低,提示miR⁃150在T1DM的发生发展中发挥关键作用,然而其作用机制目前尚未明确[4]㊂既往研究发现,miR⁃150缺失导致自然杀伤性T细胞IFN⁃γ产生增加,促进小鼠T1DM的发生[5]㊂本研究采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)处理T1DM小鼠模型,进一步研究了miR⁃150对T1DM相关自身抗体以及效应性CD4+T细胞的影响,以期为T1DM的免疫学发病机制研究提供新的线索㊂
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　miR⁃150基因敲除(miR⁃150 knockout,150KO)和野生型正常对照(wild type, WT)的C57BL/6小鼠购自美国Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA),并在华北理工大学SPF级鼠房饲养㊁繁殖㊂实验选取4~8周龄雄性150KO和WT 小鼠,每组6~8只㊂小鼠实验操作按照华北理工大学实验动物管理委员会规定进行㊂miR⁃150敲除小鼠基因型鉴定采用下列引物:F:5′⁃CAAGGACAG⁃GAACCCTTCAGCA⁃3′,R:5′⁃CCATGATGCCTGGAA GACATTTC⁃3′㊂miR⁃150KO小鼠和WT小鼠产物长度分别为262bp和866bp㊂
1.1.2　主要试剂与仪器　STZ购自Sigma公司;胰岛细胞自身抗体(ICA)和谷氨酸脱羧酶自身抗体(GADA)检测ELISA试剂盒购自MultiSciences公司;荧光素标记的抗小鼠CD4(RM4⁃5)㊁抗CD8(53⁃6.7)㊁抗B220(RA3⁃6B2)㊁抗IL⁃4(11B11)㊁抗IFN⁃γ(XMG1.2)抗体购自美国BD公司;抗小鼠Foxp3 (FJK⁃16s)抗体和细胞内染色试剂盒购自美国eBiosciences公司;引物由上海生物工程服务公司合成;血糖仪购自瑞士罗氏公司㊂
1.2　方法
1.2.1　小鼠T1DM模型制备　STZ溶于0.1mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液(Vehicle,Veh),实验组选择雄性野生型C57BL/6和miR⁃150KO小鼠,STZ 150mg/kg腹腔注射(WT+STZ;150KO+STZ),对照组小鼠注射等量溶剂(WT+Veh;150KO+Veh)㊂注射当天记为第0天,记录小鼠血糖值,以后每隔3d 分别测量,连续记录2周㊂血糖水平连续2次≥13.8mmol/L(250mg/dl)时诊断为糖尿病㊂
1.2.2　小鼠基因型检测　提取miR⁃150基因敲除小鼠(150KO)和野生型正常对照小鼠(WT)鼠尾DNA,PCR扩增检测其基因型㊂
1.2.3　ELISA检测小鼠ICA和GADA水平　STZ 注射2周后,摘除眼球取血约1ml至EP管,室温自然凝固20min,3000r/min离心20min㊂加入样品稀释液40μl以及样品10μl于相应抗体包被板, 37℃温育30min,弃去液体加入洗涤液洗板5次拍干㊂加入酶标试剂50μl,重复上述温育,洗板,拍干㊂加入显色剂37℃避光显色15min,450nm处测量吸光度(OD)㊂
1.2.4　流式细胞术分析　分别取STZ处理的150KO和WT小鼠脾脏,在含PBS的培养皿中研磨成单细胞悬液㊂4℃离心收集细胞并采用红细胞裂解液裂解红细胞,进一步采用PBS离心㊁洗涤2次后重悬细胞并计数,各组取1×106个细胞,首先加入Fc受体非特异性封闭抗体2.4G2于4℃封闭10min,加入荧光素标记抗体4℃染色30min,PBS 离心洗涤2次后上机检测,采用FlowJo软件进行结果分析㊂对于Foxp3和细胞因子的细胞内染色,收集培养细胞,经细胞表面染色后经冷PBS洗涤,用新鲜配制的固定/打孔液重悬细胞,加入2.4G24℃封闭10min,直接加入抗小鼠Foxp3㊁IFN⁃γ㊁IL⁃4和IL⁃17抗体进行细胞内染色,4℃避光孵育30min,固定,打孔液洗涤细胞2次后进行流式分析㊂
1.3　统计学分析　数据处理和统计学分析采用Microsoft Excel软件,结果以x±s表示㊂组间比较采用双尾Student′s t检验,P<0.05表示差异有统计学意义㊂2　结果
2.1　小鼠基因型鉴定　结果如图1所示,150KO
小
图1　150KO和WT小鼠基因型
Fig.1　Genotype of150KO and WT mice
㊃4962㊃中国免疫学杂志2020年第36卷
鼠扩增产生长度为262bp 的DNA 片段,WT 小鼠扩增产生长度为866bp 的DNA 片段㊂
2.2　miR⁃150缺失加速小鼠T1DM 的发生　如图2A 所示,实验期间溶剂处理组WT 和150KO 小鼠平均血糖均为正常水平且差异无统计学意义㊂STZ 处理的WT 小鼠的血糖水平从0~15d 缓慢升高,至STZ 处理后第9天血糖水平明显高于溶剂处理组㊂而150KO 小鼠在STZ 处理后仅3d 血糖水平显著升高,且在随后的3~15d 内始终显著高于STZ 处理的WT 小鼠(P <0.01)㊂与血糖水平变化一致㊂在STZ 处理后3~15d 后,150KO 小鼠的T1DM 发生率明显高于WT 小鼠(图2B)㊂
2.3　
STZ 处理不增加150KO 小鼠自身抗体水平　如图3所示,与溶剂处理WT 小鼠相比,溶剂处理150KO 小鼠ICA 和GADA 水平均显著升高(P
<
图2　miR⁃150缺失加速STZ 诱导的T1DM 发生Fig.2　
miR⁃150deletion accelerates onset of T1DM induced by STZ
Note:pared with WT mice from day 3,**.P <0.01;
pared with WT+STZ,##.P <0.
01.
图3　STZ 处理对150KO 小鼠自身抗体水平的影响Fig.3　
Effect of STZ treatment on levels of 150KO mice autoantibodies
Note:**.P <0.01.
0.01)㊂但STZ 处理只提高WT 小鼠ICA 和GADA 水平,对150KO 小鼠ICA 和GADA 水平影响无统计
学意义(P >0.05)㊂
2.4　STZ 处理的150KO 小鼠Treg 细胞显著减少　如图4所示,与WT 小鼠相比,150KO 小鼠CD4+T 细胞㊁
CD8+T 细胞和B220+B 细胞无显著变化(P >0.05),但Treg 比率显著降低(P <0.
05)㊂
图4　STZ 处理150KO 小鼠脾脏中Treg 细胞显著减少Fig.4　
Decreased Treg in spleen of STZ⁃treated 150KO mice
Note:A.Percentage of CD4+T cells,CD8+T cells and B220+B cells in
spleen;B.Percentage of CD4+Foxp3+Tregs in spleen;*.P <0.
05.
图5　STZ 处理的150KO 小鼠CD4+T 细胞IFN⁃γ和IL⁃
17表达显著上调
Fig.5　Significantly increased IFN⁃γand IL⁃17expression
in CD4+T cells of STZ⁃treated 150KO mice
Note:*.P <0.05.
㊃
5962㊃高丽清等　miR⁃150缺失通过细胞免疫应答促进Ⅰ型糖尿病的发生　第22期
2.5　STZ处理的150KO小鼠CD4+T细胞IFN⁃γ和IL⁃17表达显著上升　如图5所示,与WT小鼠CD4+T细胞相比,150KO小鼠IL⁃4阳性的CD4+T细胞比率变化无统计学意义(P>0.05),但IFN⁃γ和IL⁃17阳性的CD4+T细胞比率显著上升(P<0.05)㊂3　讨论
研究发现,由自身抗体和效应性T细胞对胰岛β细胞产生的特异免疫应答损伤在T1DM的发生发展过程中发挥重要作用[6]㊂多种自身抗体如ICA㊁GADA和胰岛素抗体(IAA)已被作为T1DM的诊断指标广泛应用于临床[7]㊂抗CD20抗体(利妥昔单抗)已被证明可通过剔除B细胞延缓非肥胖糖尿病(non⁃obesediaketic,NOD)小鼠和新发病患者T1DM 进展[8]㊂在细胞免疫应答中,CD4+T细胞通过识别T1DM易感相关HLAⅡ类分子提呈的抗原肽,活化产生多种炎症细胞因子,在T1DM胰岛炎症细胞浸润和组织损伤中发挥主导作用[9]㊂在T1DM患者和T1DM小鼠模型中均有miR⁃150表达降低的报道[10⁃12]㊂然而,miR⁃150与T1DM发生的相关机制目前尚不明确㊂本研究利用miR⁃150基因敲除小鼠并采用STZ诱导T1DM模型,探讨miR⁃150缺失对T1DM发生的影响及其免疫学机制㊂
有研究表明miR⁃150缺失促进B1细胞分化和自身抗体产生㊂患有全身性红斑狼疮和自身免疫性溶血性贫血等自身免疫性疾病的患者B淋巴细胞中miR⁃150表达降低[13,14]㊂本研究进一步证实miR⁃150表达降低与T1DM相关的自身抗体产生呈负相关㊂然而,在本研究中,miR⁃150敲除小鼠并没有发现自发糖尿病发生,只有经STZ处理后较WT小鼠血糖上升显著㊂以上结果表明,miR⁃150基因敲除小鼠体内自身抗体的增加是T1DM的初始关键事件之一,但与糖尿病高血糖和疾病持续时间无关[15]㊂
小鼠和人的研究表明CD4+Foxp3+Treg在抵抗T1DM中发挥重要作用,缺乏Treg的NOD小鼠加速T1DM发生,缺乏CD28的NOD小鼠在幼时就有较高的糖尿病发生率,而CD28是Treg发育的必需分子[16]㊂同样,去除Treg发育或生存所必需的增殖信号,如IL⁃2,会加重NOD小鼠的糖尿病[17]㊂本研究结果进一步表明Treg下调可能参与STZ诱导的miR⁃150敲除小鼠T1DM的发生,但其机制尚需进一步研究㊂
大量研究显示炎症性T细胞浸润介导的胰岛β细胞破坏与T1DM的发生密切相关[18]㊂在人类中, CD8+T细胞主要浸润胰岛,但其激活和增殖需要辅助性CD4+T细胞(Th)的帮助㊂其中,Th1介导的病理反应被认为是T1DM的重要因素,Th1细胞的特征性细胞因子IFN⁃γ促进T1DM发展㊂有研究表明人类胰岛素启动子控制IFN⁃γ表达,其可以促进小鼠糖尿病的发生发展㊂相反,抑制IFN⁃γ在NOD小鼠的表达可以预防糖尿病[19⁃21]㊂另有研究表明, T1DM患者T细胞中IL⁃17增加,尤其是在疾病的早期阶段㊂与年龄匹配的非糖尿病对照组相比,新发和长期患T1DM的儿童IL⁃17阳性的T细胞更多[22,23]㊂此外,成年T1DM患者外周血CD4+T细胞中IL⁃17表达增加[24,25]㊂本研究发现STZ处理150KO小鼠与WT小鼠相比CD4+T和CD8+T细胞无明显变化,但150KO小鼠中CD4+T细胞中IFN⁃γ和IL⁃17表达显著上升㊂表明miR⁃150缺失不影响T细胞的数量变化,但可通过促进Th1和Th17细胞的分化加速糖尿病的发生㊂
综上,本研究发现miR⁃150缺失不影响STZ处理小鼠糖尿病相关自身抗体变化,但导致Treg减少,CD4+T细胞IFN⁃γ和IL⁃17表达上升,说明miR⁃150缺失主要通过细胞免疫紊乱来加速T1DM的发生㊂另外,本研究结果提示miR⁃150的表达变化与T1DM的发生发展密切相关㊂因此,一方面,miR⁃150表达水平有望成为T1DM病情发展或治疗效果的有效预测指标;另一方面,通过基因工程方法或药物提高机体免疫细胞特别是T细胞miR⁃150的表达也有望成为T1DM免疫治疗的新策略㊂
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(编辑　陈　阳)
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江　康等　氯胺酮对帕金森大鼠脑内突触素和α⁃突触核蛋白表达的影响　第22期。