基于聚邻苯二胺和金-普鲁士蓝纳米复合物的电位型免疫传感器

基于聚邻苯二胺和金-普鲁士蓝纳米复合物的电位型免疫传感
器
冯春梁;王艳;李丽雪;柏雨辰;李爽;管云霞
【摘要】A novel potentiometric immunosensor has been presented in this paper .O‐phenylenediamine (OPD) was firstly polymerized on a carbon paste electrode (CPE) by cyclic voltammetry method ,then gold‐Prussian blue nanocomposite (Au‐PB) was electrochemically deposited onto the CPE/POPD to fabricate CPE/POPD/GNPs‐PB .Finally ,the goat anti‐mouse IgG (antibody ,Ab) were self‐assem‐bled noto the CPE/POPD/GNPs‐PB through the Au‐NH‐bond to form a potentiometric immunosen‐sor (CPE /POPD/GNPs‐PB/Ab) .Under optimal conditions ,the resulting immunosensor displayed a rapid response to antigen (mouse IgG) and the linear range of the immunosensor was from 4 .0 × 10-4 to 1 .0 × 104 μg/L (correlation coefficient r=0 .998) with a lower detection limit of 1 .14 × 10-4 μg/L and a sensitivity of 8 .51 mV/decade .Furthermore ,the immunosensor exhibited good reproducibili‐ty ,acceptable stability ,and low cost .%利用电聚合方法制备聚邻苯二胺修饰碳糊电极（CPE／POPD ），在CPE／POPD上电沉积金‐普鲁士蓝纳米复合材料（Au‐PB），制得CPE／POPD ／Au‐PB修饰电极，将羊抗小鼠IgG（抗体，Ab）通过Au‐NH‐键固定在修饰电极上，从而制得免疫传感器（CPE／POPD／Au‐PB／Ab）．利用CPE／POPD／Au‐PB／Ab对小鼠IgG （抗原，Ag ）进行检测，结果表明，在4×10－4～1．0×104μg／L质量浓度范围内，电极电势与Ag浓度呈现良好线性关系，检测下限达到1．14×10－4μg／L ，响应时间为3 min ，灵敏度为－8．51 mV／
dec‐ade ．所制备的免疫传感器具有灵敏度高、响应速度快、检测范围宽、重现
性好等优良性能．
【期刊名称】《辽宁师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2015(000)002
【总页数】5页(P203-207)
【关键词】聚邻苯二胺;电聚合;纳米金;普鲁士蓝;免疫传感器
【作者】冯春梁;王艳;李丽雪;柏雨辰;李爽;管云霞
【作者单位】辽宁师范大学化学化工学院功能材料化学研究所，辽宁大连116029;辽宁师范大学化学化工学院功能材料化学研究所，辽宁大连 116029;辽宁师范大
学化学化工学院功能材料化学研究所，辽宁大连 116029;辽宁师范大学化学化工
学院功能材料化学研究所，辽宁大连 116029;辽宁师范大学化学化工学院功能材
料化学研究所，辽宁大连 116029;辽宁师范大学化学化工学院功能材料化学研究所，辽宁大连 116029
【正文语种】中文
【中图分类】O657.1
电位型免疫传感器具有选择性好、灵敏度高、操作简单、响应速度快、价格低廉等优良性能，在食品安全、临床诊断和环境监测等领域已展现出十分广泛的应用前景[1-3].抗体的固定化是制备免疫传感器的关键技术, 导电聚合物修饰电极为抗体的
固定化提供了一种有效途径[4].Zhang[5]等人以铂电极为基础电极电聚合邻苯二胺，通过聚邻苯二胺(POPD)表面的氨基与纳米金粒子结合，进而固定乙脑抗血清抗体，该方法制备出的免疫传感器大大提高了抗体在修饰电极表面的固定量.邓婷等人[6]
结合电聚合邻苯二胺膜和纳米金自组装技术，制备出一种检测抗胰蛋白酶的压电免疫传感器，检测灵敏度高、响应性能好、再生性好、可反复再生30次，表明邻苯二胺在生物传感器研究领域具有良好的应用前景.
普鲁士蓝( PB )具有良好的化学稳定性、电催化特性，在生物传感器领域被广泛用
作电子媒介体[7-10].首先制备聚邻苯二胺修饰碳糊电极(CPE/POPD)，然后利用其表面丰富的氨基固定金-普鲁士蓝纳米复合纳米粒子(Au-PB)，再通过金氨键结合
羊抗小鼠IgG(抗体，Ab)，制备了一种电位型免疫传感器(CPE/POPD/Au-PB/Ab)，将其用于对小鼠IgG的检测.结果表明，得到的传感器灵敏度高，线性范围宽，响
应速度快，重现性好，具有一定的应用前景.
CHI660D型电化学工作站(上海辰华仪器公司)；PXJ-1B数字式离子计(江苏电分
析仪器厂)；PHS-3C精密酸度计(上海雷磁仪器公司)；LIP900超纯水系统(韩国Human公司)；KQ400DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；10
μL微量移液器(临海市华威分析仪器有限公司).
氯金酸(上海国药集团化学试剂有限公司)；固体石蜡(生工生物工程有限公司)；石
墨粉(中钢集团上海新型石墨材料有限公司)；牛血清蛋白(BSA，北京元亨圣马生物技术研究所)，羊抗小鼠IgG(抗体，Ab)，小鼠IgG(抗原，Ag)(北京索莱宝公司).
柠檬酸钠、铁氰化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化铁、硫酸、过氧化氢、邻苯二胺(OPD)均为分析纯.实验用水均为超纯水.
按文献[11]方法制备炭糊电极和CPE/POPD电极.参照文献[12]制备Au-PB复合纳米粒子.将CPE/POPD用超纯水淋洗干净后，浸入Au-PB溶液中，于1.55 V下恒电位电沉积60 min，制得CPE/POPD/Au-PB修饰电极，取出淋洗干净，浸入
0.18 g/L Ab(0.01 M pH 7.2 PBS配制)溶液中，于4 ℃孵育4 h，取出后用PBS
充分淋洗，得到CPE/POPD/Au-PB/Ab，并在0.25%的BSA中孵育30 min，以封闭其他的结合位点，提高传感器的选择性.4 ℃储存备用.
采用三电极体系：以修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，EIS表征的电解质溶液为0.1 mol/L KCl 、5 mM铁氰化钾/亚铁氰化钾溶
液(0.1 mol/L pH 7.0 PBS缓冲溶液配制).CV表征底液为0.1 mol/L pH 6.0 PBS
缓冲溶液.循环伏安测试条件：电位范围为-1.2～0.0 V，扫速为0.05 V/s.EIS参数
设定为：极化电位选择开路电位，交流微扰振幅为5 mV，频率范围为0.1 Hz～
10 kHz，采用传统的Randles等效电路对电化学体系进行模拟，得到电子传递电阻(Rct).
以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，利用数字式离子
计检测电极电势随抗原浓度的变化.首先将工作电极和参比电极置入0.02 mol/L
pH 7.4 PBS中，搅拌10 min，待空白电位稳定后，加入不同浓度的抗原溶液，
每次加样都先搅拌2 min，然后开始记录电极电势，稳定后的电势值作为传感器对一定浓度抗原溶液的响应信号.
图1是邻苯二胺聚合过程的循环伏安曲线.由图1可见，在第一周的扫描中，于
1.1 V处出现1个较大的氧化峰(峰O3)，这是由于单体OPD氧化生成自由基阳离子所致，并没有出现对应的还原峰，说明生成的自由基阳离子非常活泼，引发聚合物的形成.进行第二循环扫描时，出现1对氧化还原峰O2和R2，应归属于最终所生成的梯型POPD的氧化还原反应，表明POPD已成功修饰在CE上.为了得到导电性能良好的聚邻苯二胺炭糊电极，对其电聚合的最佳时间进行了选择.图2中，a～f分别为循环伏安扫描40，60，80，100，120，140圈得到的修饰电极的电
化学交流阻抗表征结果，其氧化还原探针为，扫描频率范围为100 mHz～10 kHz.从图中可以看出，随着聚合时间的增加，电子传递电阻(Rct)呈先减小后增大趋势，当扫描达到80圈时，修饰电极的Rct最小(图2 内嵌图曲线c)，说明此时修饰电
极的导电性能最好.继续增加扫描时间，聚合膜的厚度增加，阻碍了电子在膜与电
极表面之间的传递，导致Rct增大.因此，电聚合邻苯二胺的最佳扫描次数为80次.
为了在电极表面得到电化学活性更好的修饰膜，对Au-PB的沉积时间进行了选择，在沉积时间分别为30，40，50，60，70 min条件下，制备出CPE/POPD/Au-PB修饰电极.图3为不同沉积时间下制备出的修饰电极的交流阻抗图谱和CV曲线.由图3(A)可见，随着电沉积时间的延长，CPE/POPD/Au-PB的Rct首先依次减小，当达到60 min时，电极的Rct达到最小，继续延长沉积时间，修饰膜变得越来越厚，Rct增大，说明当沉积时间较短时， Au-PB未能全部覆盖电极表面，当沉积
时间为60 min时， Au-PB在电极表面达到最佳的覆盖量，有助于电子在电极表
面的传递，沉积时间超过60 min后，Au-PB在电极表面的覆盖层加厚，有序性
降低，阻碍了电子在电极表面的传递.由图3(B)可见，随着沉积时间的增加，修饰
电极的氧化还原峰电流先增大后减小，当沉积时间为60 min时，峰电流达到最大，此时得到的修饰膜具有较好的电化学活性，此后随着沉积量的增加，修饰膜的峰电流降低，与交流阻抗表征结果一致.因此，电沉积Au-PB的最佳时间为60 min.
炭糊电极修饰过程的EIS和CV表征结果如图4所示.在裸炭糊电极表面修饰一层POPD后，电极表面的Rct变大(曲线a, b)，当沉积一层Au-PB后，电极表面的Rct明显减小(曲线c)，这说明Au-PB具有促进电极表面电子传递的能力.固定抗体后，修饰电极的Rct再次增大(曲线d)，说明抗体成功固定于修饰电极表面.抗原与抗体发生特异性结合以后，电极表面的Rct达到最大(曲线e)，这是由于抗原-抗体复合物形成后，进一步阻碍了电子传递的孔道，导致电子传递电阻增大.结果表明，在修饰电极制备过程中，各层膜都成功地固定到了炭糊电极表面.
在优化实验条件下，即抗体孵育时间为4 h，检测底液酸度为pH=6.0，检测温度为37 ℃，利用所制备的CPE/POPD/Au-PB/Ab对2×10-4μg/L小鼠IgG进行检测，加入IgG后，首先磁力搅拌2 min，然后记录电极电势随时间的变化，结果
如图5所示.可见，当免疫反应进行至3 min后，电极电势趋于稳定，表明所制备的传感器对小鼠IgG的响应时间为3 min.图6是传感器检测小鼠IgG浓度响应曲
线和工作曲线，其检测灵敏度为8.51 mV/decade，检测范围为4.0×10-4～1.0×104μg/L，跨8个数量级，相关系数为0.998，检测下限为1.14×10-4μg/L.利用不同时间、不同批次制备的10支CPE/POPD/Au-PB/Ab对不同浓度小鼠IgG进行检测，其灵敏度及检测范围均没有明显变化(见图7)，说明该传感器具有很好的一致性.实验中对传感器的寿命进行了考察.制备5支CPE/POPD/ Au-
PB/Ab，分别于当天、3、7、11、15 d分别用于小鼠IgG的检测.结果表明，储存15 d后，电势响应值为初始值的77.5%，说明该传感器具有较好的稳定性. 利用电聚合与电沉积技术，将Au-PB与聚邻苯二胺修饰在炭糊电极表面，通过Au-NH2键作用将羊抗小鼠IgG固定到修饰电极表面，制备出一种高灵敏度免疫传感器.该传感器的响应速度快，检测范围宽，具有良好的稳定性，操作简单，成本低廉，具有一定应用前景.。