12第十二章 转基因动物和基因打靶
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第十二章 转基因动物和基因打靶
第一节 转基因动物
一、概述
（一）基本概念 1.转基因（transgenesis） 是借助基因工程将确定的外源基因导入动植物的染色体上，使 其发生整合并遗传的过程。 广义地说，向细菌、微生物、动植物细胞、动植物个体导入外 源基因都可称之为转基因，所以转化（transformation）、转导 （transduction）和转染（transfection）在转基因这个概念上得 到了统一。 2.转基因动物（transgenic animal） 是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，外源基因 能够表达并能稳定传代（按孟德尔定律遗传）的一类动物。
发育场所
胚胎细胞（核） （去核）未受精的卵细胞
母体宫腔
体细胞（核） （去核）未受精的卵细胞
母体宫腔 克隆的是自己 “借腹复 制” 多利
关键区别
举例
克隆的是子代 “借腹怀胎”
“多利”问世前的克隆羊等
多利的诞生的过程 1. 取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。
2. 取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因，换上第 一只羊乳腺细胞的基因（“掉包”）－>放电激活该卵细胞， 使之象正常受精卵进行细胞分裂－>到一定阶段，胚胎形成。 3. 将其移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一 样）产下“多利”，这样，一只与第一只羊百分之百一样的 “复制品”诞生了。 不辨父母的“多利”的诞生，推翻了遗传学上一条上百 年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。
（三）基因工程技术引起人们思考的3个问题 1. 能否跨越细胞水平，直接在机体整体水平上进行操作。 2. 能否培育高效表达基因工程产品的动植物，取代目前大 量细菌培养和细胞培养呢? 如果获得这样的动植物，人们获得所需要的生物活性物 质就像挤牛奶那么方便（如培育一种高效表达胰岛素动物）， 只需定期从这个生物工厂收获就行了。 3. 能否利用基因工程技术创造高产，抗病和具有某种特殊 性能的新品种乃至改造人类的基因结构呢？ 这就是我们学习和讨论本章的目的。
三、基本步骤 研制转基因动物的基本步骤包括：
1. 转基因载体的构建 。
2. 通过显微注射和基因型鉴定获得携 带外源基因的转 基因动物。
4. 通过转基因动物的表型分析研究外源基因的功能。
四、转基因载体的构建及制备 （一） 载体 由调控序列和结构基因组成。选择基因组DNA构建转基 因载体应能使外源基因在转基因动物中表达的可能性大，且更 具有天然的组织特异性。 （二） 外源基因 包括目的基因和报告基因，二者拼接成融合基因。外源基 因的cDNA序列内顺式作用元件和结构基因组成的完整的转录 单位。 （三）启动子 选择可诱导的强启动子，如cre/LoxP、Flp/FRT及四环素 应答调控系统等。 （四）注射前载体应纯化、线化，尽可能去除酚、SDS等 有害物质，减少对受体细胞的毒性。合适注射DNA浓度为1～ 5μg/ml。
（二）基因工程技术的特点 上个世纪70年代诞生的基因工程技术特点是“分子
水平操作，细胞水平表达”，是把外源基因间接（载体 介导）或直接转入细胞内，利用细胞这个报小的生物工 厂达到生产或科研的目的。 这里基因转移的对象是细胞，转移过程是在细胞水 平上进行的，目的只是把改造了单个细胞的遗传特性。
获得产品或进行实验研究需要大量的细菌培养或细 胞培养技术。
（一）受精卵原核显微注射法 这是最早发展也是最有成效的一种外源基因直接导 入的方法，迄今产生的许多转基因哺乳动物绝大多是通 过这个途径获得的。哺乳动物的受精卵极小，直径只有
100～150um，要将外源基因注入更小的原核内，必须 应用显微注射仪上装置的纤维毛细管（直径0.5～1μm） 在显微镜下进行。
（四）转基因生物成就 转基因技术是在基因工程和胚胎工程的成就基础上 发展起来的。这种20世纪50年代发展起来的细胞核移植 技术，使人们可以从一个细胞中取出整个细胞核（含完 整的基因组），并将其转移到去核卵中，此卵可发育生 长成完整的个体，并带有外源性的全套基因。 1. 超级小鼠 1981年 Brinster和Palmiter将大鼠生长激素因子与 小鼠金属硫蛋白的基因连在一起，构成MT1GH基因－> 微注到小鼠受精卵中－>在植入假孕鼠子宫中－>发育生 长－>共产出21只小鼠，其中7只带外源基因，而其中6 只小鼠大1倍左右，这即著名超级小鼠或巨鼠。
（二）胚胎干细胞介导 胚胎多能干细胞指胚胎囊胚期的内细胞团中尚未分化的胚胎细 胞。这种细胞具有高度分化的潜能。 小鼠胚胎干细胞由美国剑桥大学Evans和Kauffman两个人 1981年首先分离并体外培养成功（故又称EK细胞，EK为Evans和 Kauffman两个字头的组合，也有人称这是embryonic karyotype的 缩写）。胚胎多能干细胞法技术路线（总体途径）如下： 1.建立EK细胞系，多能干细胞分离。 各学者建立EK细胞系的技术路线不尽相同，但基本思路一致。 ①选择一定发育阶段的胚胎，因为只有该发育阶段胚胎在体外培 养系统中才能生长。 ②培养条件要促进多能干细胞生长而不利于其它分化细胞的生 长。如果胚胎已经着床，则分离比较困难，Evans创造了。 ③延迟囊胚法：通过改变母体激素和切除卵巢，延迟囊胚的着 床，使其内细胞团内数目增加，分离移植体外后，大量未分化干细 胞正处于增殖阶段。
二、 基本原理 转基因动物的基本原理是：
将目的基因（或基因组片段）－>用显微注射等方
法－>注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中－> 使目的基因整合到基因组中－>然后将此受精卵或着床前 的目的胚胎细胞再植入受体细胞输卵管（或子宫）中， 使其发育成携带有外源基因的转基因动物－>人们可以通 过分析转基因和动物表型的关系－>揭示外源基因的功能， 也可通过转入外源基因培养优良的动物品种。
2.克隆羊 1997年2月“Nature”杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研究所和 PPL生物技术向世界宣布1996年7月，他们培育出了一只名叫“多 利”的“克隆羊”时，全世界震惊的程度不亚于当初对原子弹的爆 炸，有人惊呼“克隆来了”。为什么？此克隆非彼克隆。
胚胎细胞克隆 体细胞克隆
供体细胞 受体细胞
8.原核显微注射的优缺点： 优点： ①外源基因在宿主动物染色体上的整合效率高，在小鼠和家兔， 整合率可达25％～30％。 ②不要载体 ③由于外源基因是在雌雄原核融合之前导入的，外源基因的整 合亦是在此期间整合到宿主染色体内，因此产生的转基因动物所有 组织和细胞，包括抗体细胞和生殖细胞，经常有这一外源基因，且 整合的位置和拷贝数基本上一样。 ④导入的外源基因长度可达50kb，能够满足转基因动物的培养 要求。近有导入长达100kb外源基因的报道。 缺点： ①需要显微注射仪等精密设备，操作技术复杂，已导入外源基 因的受精卵常需通过手术移至假孕受体的输卵管内。 ②某些动物的受精卵原核看不清楚，需要干涉相差显微镜（绵 羊）或经1500g离心3分钟，使胞质浓染一端，才能暴露，这既增加 了操作 复杂性，又影响了受精卵的成活率。 ③整合是随机的，宿主染色体常在整合部位发生突变，宿主基 因也常被插入失活，从而导致许多转基因动物发生个体发育障碍、 不育、死亡，甚至早期胚胎死亡的现象。
3.转基因 以体外培养的EK细胞为桥梁，结合细胞遗传学及基因工程技术， 定向改造这些细胞，如用不同的外源目的基因进行转化或转染，筛选其 中已有外源基因并能高效表达的EK细胞再注入受体囊胚腔内，则由其 发育而成的胚胎及个体的部分组织将整合内外源目的基因，并可能出现 特异性表达。据统计，生殖细胞中整合外源基因的比率约30％。通过对 嵌合体动物的繁殖和筛选，即可获得整合有外源目的基因的转基因动物。 4.胚胎干细胞介导的优缺点 优点： ①可以通过各种方法对EK细胞系体外进行外源基因的导入。 ②转化细胞的鉴定和筛选比较方便，即使外源基因导入只有10-6， 也可以选出。 ③外源基因的整合数目、位点、表达水平与其调节及插入基因的稳 定性的检定等均可在细胞水平进行，故预期性和可控程度都明显高于受 精卵的显微镜法。 ④注射囊胚操作较简易，且囊胚可以通过非手术途径直接注入受体 宫腔，胚胎存活率较高。 缺点： ①建立、保存、维持EK系难度较大 ②导入受体囊胚后如果发生性嵌合，则将导致生殖机能紊乱合不育。
延迟囊胚体外培养1～2周后，可在饲养层上出现滋胚层、上皮 样内胚层细胞和干细胞（EK细胞），据形态特征（体积小，具有一 个大核和1～2个核仁）挑选，培养传代，建立EK细胞系。 2.EK细胞的特性鉴定 （1）核型鉴定： EK细胞应有整二倍体的核型，呈XX或XY型，并 能在嵌合体中形成有功能的配子，小鼠EK细胞染色体总数为40。 （2）分化潜能的鉴定
五、转基因动物常用的方法 为使外源基因进入种系（germ line），将外源基因 转入受体（生殖）细胞，从导入基因方式划分，可有： （一）受精卵原核直接显微注射法 （二）胚胎多能干细胞介导法
（三）精子载体导入法
（四）逆转录病毒感染导入法 （五）电泳冲法 （一）（五）为直接法，（二）（三）（四）为间 接法，每一方法各有其优缺点，技术成熟程度亦不相同。
胚胎细胞克隆体细胞克隆供体细胞胚胎细胞核体细胞核受体细胞去核未受精的卵细胞去核未受精的卵细胞发育场所母体宫腔母体宫腔关键区别克隆的是子代借腹怀胎克隆的是自己举例多利问世前的克隆羊等多利多利的诞生的过程取出第二只母羊未受精的卵细胞取出基因换上第一只羊乳腺细胞的基因掉包放电激活该卵细胞使之象正常受精卵进行细胞分裂到一定阶段胚胎形成
（三） 逆转录病毒感染导入 1.总体技术路线：将插入外源目的基因的逆转录病毒载体DNA －>通过辅助细胞包装成感染滴度的病毒颗粒－>用来感染已经除去 透明带的着床前胚胎－>随后直接导入受体子宫 2.优缺点 优点： ①感染率高。100％的细胞被感染，细胞损伤小，胚胎成活率高。 ②外源基因两端可连接逆转录病毒的LTR，有利于其转录。 ③逆转录病毒宿主范围广，适用于多种动物。 ④宿主染色体DNA在整位位点附近较少，发生缺失和重排，因 此转基因动物也较少出现不育和其它生理异常现象。 缺点： ①整合效率不高，外源基因特别不易整合到生殖细胞中去。 ②逆转录病毒的容纳量在10kb以下，所以不能插入较大的外源 基因。 ③逆转录病毒的DNA序列可能干扰外源基因的表达。 ④对于逆转录病毒的长期感染或整合，应用增殖型逆转录病毒 载体，人们还有疑虑，可导致转基因动物的病毒血症乃至死亡。
①在没有饲养条件，体外培养EK细胞呈悬浮生长，并聚集成许 多团块——简单类胚，随后形成囊胚，并出现神经、肌肉和软骨等 紊乱的细胞和结构。
②将EK细胞注入正常发育的囊胚中，EK将与受体的内细胞团一 起发育共同构成嵌合体。 ③将106～109个EK细胞皮下注射至同种小鼠的胁腹部，将在 3～6周形成由不同类型细胞形成直径达1～2cm的畸胎瘤。
下面以Palmiter等人培育“巨型小鼠”的技术路线说明显微注射法的总 体途径。 1.动物的选择 应选择： ①产仔率高 ②基因背景一致的以利于： 1）显微注射 2）外源基因整合 3）表达的检测 ③品种或品系 和受精卵原核清楚 并获得亲、子代转基因动物。(在小鼠，人们可选用ICR，C57等动物 作为受精卵供体，另用昆明小鼠作为或供体) 2.受精卵的准备 ①供体准备 ②受精卵采集（交配后14～16小时） 3.受精卵的显微注射 向雄原核内注入外源基因的拷贝数几十至几千 个不等， 但注入量衡定，一般液量每个原核不超过3皮升（pl）。 4.假孕受体的准备 5.胚胎移植于假孕受体宫腔内发育成熟（移植受精卵含有外源基因） 6.转基因动物的鉴定 包括： 1）外源基因的整合测定 (如点杂交、 SouthernDNA杂交） 2）表达产物的检测（如Northern、Western试验、 免疫荧光，免疫、中和试验、基因回归等） 3）生物效应的观察 标本为：DNA、RNA、血清、体液、乳、尿以及组织和细胞等。 7.纯系转基因动物的培育 迄今获得的转基因、外源基因大多为单条染色体整合。由于生殖细胞 减数分裂，子代动物总有一部分不含有外源目的基因，且在垂直传递中也 常发生丢失现象。因此，为使子代动物稳定地携带外源目的基因，保持特 定地遗传性状，必须根据整合测定的结果，按照孟德尔的经典遗传学定律， 制定合理的纯系动物培育方案：将不同的雌雄转基因动物配对交配，筛选 等位基因中均整合有外源目的基因的子代个体，即特定基因的纯系动物。
第一节 转基因动物
一、概述
（一）基本概念 1.转基因（transgenesis） 是借助基因工程将确定的外源基因导入动植物的染色体上，使 其发生整合并遗传的过程。 广义地说，向细菌、微生物、动植物细胞、动植物个体导入外 源基因都可称之为转基因，所以转化（transformation）、转导 （transduction）和转染（transfection）在转基因这个概念上得 到了统一。 2.转基因动物（transgenic animal） 是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，外源基因 能够表达并能稳定传代（按孟德尔定律遗传）的一类动物。
发育场所
胚胎细胞（核） （去核）未受精的卵细胞
母体宫腔
体细胞（核） （去核）未受精的卵细胞
母体宫腔 克隆的是自己 “借腹复 制” 多利
关键区别
举例
克隆的是子代 “借腹怀胎”
“多利”问世前的克隆羊等
多利的诞生的过程 1. 取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。
2. 取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因，换上第 一只羊乳腺细胞的基因（“掉包”）－>放电激活该卵细胞， 使之象正常受精卵进行细胞分裂－>到一定阶段，胚胎形成。 3. 将其移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一 样）产下“多利”，这样，一只与第一只羊百分之百一样的 “复制品”诞生了。 不辨父母的“多利”的诞生，推翻了遗传学上一条上百 年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。
（三）基因工程技术引起人们思考的3个问题 1. 能否跨越细胞水平，直接在机体整体水平上进行操作。 2. 能否培育高效表达基因工程产品的动植物，取代目前大 量细菌培养和细胞培养呢? 如果获得这样的动植物，人们获得所需要的生物活性物 质就像挤牛奶那么方便（如培育一种高效表达胰岛素动物）， 只需定期从这个生物工厂收获就行了。 3. 能否利用基因工程技术创造高产，抗病和具有某种特殊 性能的新品种乃至改造人类的基因结构呢？ 这就是我们学习和讨论本章的目的。
三、基本步骤 研制转基因动物的基本步骤包括：
1. 转基因载体的构建 。
2. 通过显微注射和基因型鉴定获得携 带外源基因的转 基因动物。
4. 通过转基因动物的表型分析研究外源基因的功能。
四、转基因载体的构建及制备 （一） 载体 由调控序列和结构基因组成。选择基因组DNA构建转基 因载体应能使外源基因在转基因动物中表达的可能性大，且更 具有天然的组织特异性。 （二） 外源基因 包括目的基因和报告基因，二者拼接成融合基因。外源基 因的cDNA序列内顺式作用元件和结构基因组成的完整的转录 单位。 （三）启动子 选择可诱导的强启动子，如cre/LoxP、Flp/FRT及四环素 应答调控系统等。 （四）注射前载体应纯化、线化，尽可能去除酚、SDS等 有害物质，减少对受体细胞的毒性。合适注射DNA浓度为1～ 5μg/ml。
（二）基因工程技术的特点 上个世纪70年代诞生的基因工程技术特点是“分子
水平操作，细胞水平表达”，是把外源基因间接（载体 介导）或直接转入细胞内，利用细胞这个报小的生物工 厂达到生产或科研的目的。 这里基因转移的对象是细胞，转移过程是在细胞水 平上进行的，目的只是把改造了单个细胞的遗传特性。
获得产品或进行实验研究需要大量的细菌培养或细 胞培养技术。
（一）受精卵原核显微注射法 这是最早发展也是最有成效的一种外源基因直接导 入的方法，迄今产生的许多转基因哺乳动物绝大多是通 过这个途径获得的。哺乳动物的受精卵极小，直径只有
100～150um，要将外源基因注入更小的原核内，必须 应用显微注射仪上装置的纤维毛细管（直径0.5～1μm） 在显微镜下进行。
（四）转基因生物成就 转基因技术是在基因工程和胚胎工程的成就基础上 发展起来的。这种20世纪50年代发展起来的细胞核移植 技术，使人们可以从一个细胞中取出整个细胞核（含完 整的基因组），并将其转移到去核卵中，此卵可发育生 长成完整的个体，并带有外源性的全套基因。 1. 超级小鼠 1981年 Brinster和Palmiter将大鼠生长激素因子与 小鼠金属硫蛋白的基因连在一起，构成MT1GH基因－> 微注到小鼠受精卵中－>在植入假孕鼠子宫中－>发育生 长－>共产出21只小鼠，其中7只带外源基因，而其中6 只小鼠大1倍左右，这即著名超级小鼠或巨鼠。
（二）胚胎干细胞介导 胚胎多能干细胞指胚胎囊胚期的内细胞团中尚未分化的胚胎细 胞。这种细胞具有高度分化的潜能。 小鼠胚胎干细胞由美国剑桥大学Evans和Kauffman两个人 1981年首先分离并体外培养成功（故又称EK细胞，EK为Evans和 Kauffman两个字头的组合，也有人称这是embryonic karyotype的 缩写）。胚胎多能干细胞法技术路线（总体途径）如下： 1.建立EK细胞系，多能干细胞分离。 各学者建立EK细胞系的技术路线不尽相同，但基本思路一致。 ①选择一定发育阶段的胚胎，因为只有该发育阶段胚胎在体外培 养系统中才能生长。 ②培养条件要促进多能干细胞生长而不利于其它分化细胞的生 长。如果胚胎已经着床，则分离比较困难，Evans创造了。 ③延迟囊胚法：通过改变母体激素和切除卵巢，延迟囊胚的着 床，使其内细胞团内数目增加，分离移植体外后，大量未分化干细 胞正处于增殖阶段。
二、 基本原理 转基因动物的基本原理是：
将目的基因（或基因组片段）－>用显微注射等方
法－>注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中－> 使目的基因整合到基因组中－>然后将此受精卵或着床前 的目的胚胎细胞再植入受体细胞输卵管（或子宫）中， 使其发育成携带有外源基因的转基因动物－>人们可以通 过分析转基因和动物表型的关系－>揭示外源基因的功能， 也可通过转入外源基因培养优良的动物品种。
2.克隆羊 1997年2月“Nature”杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研究所和 PPL生物技术向世界宣布1996年7月，他们培育出了一只名叫“多 利”的“克隆羊”时，全世界震惊的程度不亚于当初对原子弹的爆 炸，有人惊呼“克隆来了”。为什么？此克隆非彼克隆。
胚胎细胞克隆 体细胞克隆
供体细胞 受体细胞
8.原核显微注射的优缺点： 优点： ①外源基因在宿主动物染色体上的整合效率高，在小鼠和家兔， 整合率可达25％～30％。 ②不要载体 ③由于外源基因是在雌雄原核融合之前导入的，外源基因的整 合亦是在此期间整合到宿主染色体内，因此产生的转基因动物所有 组织和细胞，包括抗体细胞和生殖细胞，经常有这一外源基因，且 整合的位置和拷贝数基本上一样。 ④导入的外源基因长度可达50kb，能够满足转基因动物的培养 要求。近有导入长达100kb外源基因的报道。 缺点： ①需要显微注射仪等精密设备，操作技术复杂，已导入外源基 因的受精卵常需通过手术移至假孕受体的输卵管内。 ②某些动物的受精卵原核看不清楚，需要干涉相差显微镜（绵 羊）或经1500g离心3分钟，使胞质浓染一端，才能暴露，这既增加 了操作 复杂性，又影响了受精卵的成活率。 ③整合是随机的，宿主染色体常在整合部位发生突变，宿主基 因也常被插入失活，从而导致许多转基因动物发生个体发育障碍、 不育、死亡，甚至早期胚胎死亡的现象。
3.转基因 以体外培养的EK细胞为桥梁，结合细胞遗传学及基因工程技术， 定向改造这些细胞，如用不同的外源目的基因进行转化或转染，筛选其 中已有外源基因并能高效表达的EK细胞再注入受体囊胚腔内，则由其 发育而成的胚胎及个体的部分组织将整合内外源目的基因，并可能出现 特异性表达。据统计，生殖细胞中整合外源基因的比率约30％。通过对 嵌合体动物的繁殖和筛选，即可获得整合有外源目的基因的转基因动物。 4.胚胎干细胞介导的优缺点 优点： ①可以通过各种方法对EK细胞系体外进行外源基因的导入。 ②转化细胞的鉴定和筛选比较方便，即使外源基因导入只有10-6， 也可以选出。 ③外源基因的整合数目、位点、表达水平与其调节及插入基因的稳 定性的检定等均可在细胞水平进行，故预期性和可控程度都明显高于受 精卵的显微镜法。 ④注射囊胚操作较简易，且囊胚可以通过非手术途径直接注入受体 宫腔，胚胎存活率较高。 缺点： ①建立、保存、维持EK系难度较大 ②导入受体囊胚后如果发生性嵌合，则将导致生殖机能紊乱合不育。
延迟囊胚体外培养1～2周后，可在饲养层上出现滋胚层、上皮 样内胚层细胞和干细胞（EK细胞），据形态特征（体积小，具有一 个大核和1～2个核仁）挑选，培养传代，建立EK细胞系。 2.EK细胞的特性鉴定 （1）核型鉴定： EK细胞应有整二倍体的核型，呈XX或XY型，并 能在嵌合体中形成有功能的配子，小鼠EK细胞染色体总数为40。 （2）分化潜能的鉴定
五、转基因动物常用的方法 为使外源基因进入种系（germ line），将外源基因 转入受体（生殖）细胞，从导入基因方式划分，可有： （一）受精卵原核直接显微注射法 （二）胚胎多能干细胞介导法
（三）精子载体导入法
（四）逆转录病毒感染导入法 （五）电泳冲法 （一）（五）为直接法，（二）（三）（四）为间 接法，每一方法各有其优缺点，技术成熟程度亦不相同。
胚胎细胞克隆体细胞克隆供体细胞胚胎细胞核体细胞核受体细胞去核未受精的卵细胞去核未受精的卵细胞发育场所母体宫腔母体宫腔关键区别克隆的是子代借腹怀胎克隆的是自己举例多利问世前的克隆羊等多利多利的诞生的过程取出第二只母羊未受精的卵细胞取出基因换上第一只羊乳腺细胞的基因掉包放电激活该卵细胞使之象正常受精卵进行细胞分裂到一定阶段胚胎形成
（三） 逆转录病毒感染导入 1.总体技术路线：将插入外源目的基因的逆转录病毒载体DNA －>通过辅助细胞包装成感染滴度的病毒颗粒－>用来感染已经除去 透明带的着床前胚胎－>随后直接导入受体子宫 2.优缺点 优点： ①感染率高。100％的细胞被感染，细胞损伤小，胚胎成活率高。 ②外源基因两端可连接逆转录病毒的LTR，有利于其转录。 ③逆转录病毒宿主范围广，适用于多种动物。 ④宿主染色体DNA在整位位点附近较少，发生缺失和重排，因 此转基因动物也较少出现不育和其它生理异常现象。 缺点： ①整合效率不高，外源基因特别不易整合到生殖细胞中去。 ②逆转录病毒的容纳量在10kb以下，所以不能插入较大的外源 基因。 ③逆转录病毒的DNA序列可能干扰外源基因的表达。 ④对于逆转录病毒的长期感染或整合，应用增殖型逆转录病毒 载体，人们还有疑虑，可导致转基因动物的病毒血症乃至死亡。
①在没有饲养条件，体外培养EK细胞呈悬浮生长，并聚集成许 多团块——简单类胚，随后形成囊胚，并出现神经、肌肉和软骨等 紊乱的细胞和结构。
②将EK细胞注入正常发育的囊胚中，EK将与受体的内细胞团一 起发育共同构成嵌合体。 ③将106～109个EK细胞皮下注射至同种小鼠的胁腹部，将在 3～6周形成由不同类型细胞形成直径达1～2cm的畸胎瘤。
下面以Palmiter等人培育“巨型小鼠”的技术路线说明显微注射法的总 体途径。 1.动物的选择 应选择： ①产仔率高 ②基因背景一致的以利于： 1）显微注射 2）外源基因整合 3）表达的检测 ③品种或品系 和受精卵原核清楚 并获得亲、子代转基因动物。(在小鼠，人们可选用ICR，C57等动物 作为受精卵供体，另用昆明小鼠作为或供体) 2.受精卵的准备 ①供体准备 ②受精卵采集（交配后14～16小时） 3.受精卵的显微注射 向雄原核内注入外源基因的拷贝数几十至几千 个不等， 但注入量衡定，一般液量每个原核不超过3皮升（pl）。 4.假孕受体的准备 5.胚胎移植于假孕受体宫腔内发育成熟（移植受精卵含有外源基因） 6.转基因动物的鉴定 包括： 1）外源基因的整合测定 (如点杂交、 SouthernDNA杂交） 2）表达产物的检测（如Northern、Western试验、 免疫荧光，免疫、中和试验、基因回归等） 3）生物效应的观察 标本为：DNA、RNA、血清、体液、乳、尿以及组织和细胞等。 7.纯系转基因动物的培育 迄今获得的转基因、外源基因大多为单条染色体整合。由于生殖细胞 减数分裂，子代动物总有一部分不含有外源目的基因，且在垂直传递中也 常发生丢失现象。因此，为使子代动物稳定地携带外源目的基因，保持特 定地遗传性状，必须根据整合测定的结果，按照孟德尔的经典遗传学定律， 制定合理的纯系动物培育方案：将不同的雌雄转基因动物配对交配，筛选 等位基因中均整合有外源目的基因的子代个体，即特定基因的纯系动物。