淀粉酶活力的测定

七. 思考题
1、在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？ 2、本实验中两次加入NaOH溶液的意义是什么?
八、分析
1.三种酶活力大小顺序是怎样，为什么是这样？ 2.酶液的稀释倍数是否要改变。 3.计算酶液的总活力、回收率。
试管排列顺序
室温
装约20 mL淀粉溶液， 标记，转至37℃水浴
锅中
37 ℃
粗酶液
1
空白
淀粉
盐析
2
脱盐
3
B1
B2
B3
B1
B2
B3
F1
F2
F3
F1
F2 F3
因淀粉中含有少量还原糖， 某些溶液有色素、杂质，需
查看酶不水解淀粉的情况
0 时刻
5 min时刻
实验编号
粗酶液 (1)
盐析液 (2)
脱盐液 (3)
实验七 淀粉酶活力的测定
一、实验目的
掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法
二、实验原理
酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能 力的大小用酶的活力来表示。酶活力也称酶活 性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催 化一定的化学反应的初速度来表示。
本实验是以一定量的α-淀粉酶液，于37 ℃ 、 pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间内将淀粉 转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色 测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的 初速度，即酶的活力
这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37 ℃ 、 pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1 mg还原 糖所需要的酶量。
1 U=1 mg 还原糖/min·mL 酶
三. 实验材料及设备
1、材料 淀粉酶液（粗酶液、盐析液、脱盐液） 2、仪器 分光光度计 恒温水浴 沸水浴 3、器材
刻度试管： 25 mL×17 移 液 管： 1 mL×3（取稀释后的酶液） 烧 杯： 250 mL×1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1 移 液 器：专取NaOH 注 射 器：专取蛋白样品
四、试剂的配制
1、淀粉溶液（0.5%） 称取5 g可溶性淀粉，溶于1000 mL热水中。
2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 3、磷酸缓冲液（ 0.1 mol/L，pH6.8 ），含0.3% NaCl 4、NaOH溶液（2.5mol/L）
五. 操作步骤
1、淀粉酶的制备 （1）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗
NaOH (ml)
11
11
11
预热的淀粉
各 1 ml，迅速摇匀
酶促反应
37 ℃ 水浴 5 min (准确计时)
NaOH (ml) DNS试剂 显色反应
比色
11
11
11
各 2 ml，摇匀
沸水浴 5 min，冷却，各用水定容至25ml，摇匀
以0号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光值
记录A540
六. 结果处理
操作
0号管 0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 B1 B1’ F1 F1’ B2 B2’ F2 F2’ B3 B3’ F3 F3’
淀粉酶液 (ml)
0.3
0.2
0.5
H2O (ml) 3.5 pH 6.8缓冲液 0.3 ％ NaCl
预热
各 1 ml 各 1 ml 摇匀， 37 ℃ 水浴 2 min
1、分别计算0时刻、5 min时刻的A540nm平均值。 2、根据图表中的实验结果，并利用实验 “3,5-二
硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准 曲线，计算淀粉酶的活力。
需要详细过程。
5 min时刻吸光值
5 min时刻还原糖mg数
0 min时刻吸光值
0 min时刻还原糖mg数
二者相减，计算酶活力。 1 U=1 mg 还原糖/min·mL 酶*稀释倍数
酶提取液解冻，取上清液0.05Fra bibliotekmL，加蒸馏水稀释 到25 mL，摇匀备用 （2）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析 蛋白质解冻，取上清液0.05 mL，加蒸馏水稀释到 25 mL，摇匀备用 （3）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取 0.05 mL，稀释。
收集1管的同学，将0.05 mL稀释到15 mL 收集2管的同学，将0.05 mL稀释到10 mL