质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法) S2517实验室 第三组
碱裂解法质粒小量提取_文档
一碱裂解法质粒小量提取试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。
其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。
十二烷基磺进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA 和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。
由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。
在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。
碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。
仪器与主要试剂主要试剂：溶液I：50 mmol/L葡萄糖10 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)溶液II：200 mmol/L NaOH 1% SDS溶液III：3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液酚氯仿异丙醇（25：24：1）95%乙醇%70乙醇TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTARNaseA方法：1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16～18小时2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟6．加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟7．12000rpm离心15分钟8．将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。
质粒DNA的提取-碱裂解法实验原理及步骤
实验二质粒DNA的提取－碱裂解法一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。
二、仪器及试剂1.仪器及耗材：37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。
2.试剂及配制：LB培养液的配制：酵母浸提物 5.0 g；胰蛋白胨 10.0 g；NaCl 10.0 g；依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH （约0.2 ml）调节培养液的pH值至7.0。
质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法) S2517实验室 第三组
Tris-HCl：三（羟甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基 甲烷。在这里，Tris缓冲液主要是做核酸和蛋白质的溶剂。
EDTA：四乙酸二氨基乙烷（二氨基乙烷四乙酸），又叫托立龙、依 地酸。EDTA 是一种重要的络合剂。EDTA用途很广，可用作彩色感 光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添 加剂，血液抗凝剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂 的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶 性配合物。在这里主要作用是降低细胞膜的稳定性。
有问题？您说话
谢谢聆听
溶液二的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白质在碱 性条件下变性。溶液需要新鲜配制。
溶液三的作用是使pH恢复中性，质粒DNA复性，而染色体DNA与 蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。溶液三使用前需用冰预冷。
2.实验中加入酚-氯仿、无水乙醇、70%乙醇和RNaseA的作用分别 是什么？
酚——变性蛋白质； 氯仿——萃取溶液中的酚； 无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒DNA； 70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分； RNase A—— 对RNA有水解作用
2.氨苄西林 100 mg/mL。
3.溶液一 50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 10mmol/L EDTA (pH 8.0)。
4.溶液二 （新鲜配制） 0.2mol/L NaOH , 1％ SDS。 5.溶液三 0.5mol/L醋酸钾60 mL , 冰醋酸11.5 mL ，H2O 28.5 mL。 6.酚/氯仿 将酚和氯仿等体积混合，用Tris-HCl平衡至pH 7.6 ， 置于 棕色瓶中4℃保存。 7.TE缓冲液（pH 8.0) 10mol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 1mmol/L EDTA 8.RNase A (10 mg/mL)。 9.70%乙醇、无水乙醇。
质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法).
【操作方法】
将含有pQE30质粒的大肠杆菌TG1 10µl接种到10ml含氨卞 青霉素(100µg/ml)的LB培养液中，37℃振摇过夜 取1.5ml培养物转入离心管中，10000r/min离心1分钟,吸净 上清液。 将细菌沉淀物悬浮于100µl冰冷的溶液Ｉ中,用旋窝振荡器彻 底悬浮细菌沉淀。 加200µl新鲜配制的溶液Ⅱ,盖紧管口,轻缓颠倒离心管5次,以 混合内容物,禁止剧烈震荡,置于冰浴中2min。 加入150µl冰预冷的溶液Ⅲ ，盖上管口，反复颠倒数次,然后 使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,随后置于冰浴中5分 钟
【思考题】 思考题】
1.
溶液Ⅰ 溶液Ⅱ 溶液Ⅲ的作用分别是什么 加溶液 加溶液Ⅰ 溶液Ⅱ 溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用分别是什么?加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、 溶液Ⅲ时要注意哪些问题? 溶液Ⅲ时要注意哪些问题
溶液Ⅰ的作用 溶液Ⅰ的作用：分散细胞，螯合金属离子使金属酶失活。 注意：加入溶液后一定要彻底悬浮细菌沉淀，否则所提质粒DNA的纯度 及得率会大大降低。 溶液Ⅱ的作用：使细胞壁在碱性条件下破裂，核酸和蛋白质变性。 溶液Ⅱ的作用 注意：不能剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基 因组片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免 质粒受到破坏。如果未变的清亮，可能菌体过多，裂解不彻底，应减 少菌体量。 溶液III的作用 的作用：使pH值恢复至中性，质粒DNA复性，染色体DNA与 溶液 的作用 蛋白质-SDS复合物沉淀。 注意：溶液加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
【实验原理】
在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变 性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条 互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将 pH值中和至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原 来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性 而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体 DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物 等一起沉淀下来而被除去，然后用酚-氯仿抽提， 进一步纯化质粒DNA。上清液中的质粒DNA。上 清液中的质粒DNA因不溶于70%乙醇，可在加入 乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀。
质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法)
实验步骤
• 10、12000r/min离心10min，去上清液，加 1ml70%乙醇，短暂振摇，然后再 12000r/min离心5min • 11、除去所有上清液，待残余乙醇挥发干 净后，加30µLTE缓冲液（PH=8.0）溶解沉 淀，再加1µlRNaseA（1mg/ml），37℃保 温15min，取出后即可用酶切分析或置于20℃保存备用 。
注意事项
• 溶液2的作用：使细胞壁在碱性条件下破裂， 核酸和蛋白质变性。 • 注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡， 以免打乱基因组DNA，造成提取的质粒中 混有基因组片段。此时菌液应变得清凉粘 稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受 到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体 过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
质粒DNA的小量快速提取 质粒DNA的小量快速提取 DNA 碱裂解法） （碱裂解法）
ApaLI (178)
P(BLA) ALPHA
主讲人： 主讲人：
XmaI (413) SmaI (415)
ApaLI (2367)
EcoRI (397) AvaI (413)
APr
pUC19
BamHI (418) PstI (440) HindIII (448)
质粒的应用
• 大多数基因工程使用松弛型质粒。 • 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受 毒害致死的基因。 • 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入 细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基 因运载工具在基因工程中具有极广泛的应 用价值。
质粒特点
• 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细 胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。 • 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移 到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９ ５２年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒DNA的小量快速提取
其他杂质的去除
细菌细胞破坏后，细胞内容物释放出来，除了DNA 外，还有RNA、蛋白质、细胞器碎片、可溶性杂质 如糖、有机酸碱及盐分等。这些都必须通过相应的 技术手段去除。 碱变性中所用的NaOH-SDS溶液还可沉淀大分子 RNA及部分蛋白质。 酚、氯仿可去除蛋白质。 无水乙醇、异丙醇可沉淀核酸，去除可溶性杂质。 两者的区别？ RNase可降解RNA。
一、基因工程简介
概念：应用酶学的方法 在体外将各种来源的遗传 应用酶学的方法, 应用酶学的方法 同源的或异源的、原核的或真核的、 物质 （ 同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA)与载体 与载体DNA接合成一具有自我复 的或人工的 与载体 接合成一具有自我复 制能力的DNA分子 复制子 分子( 制能力的 分子 复制子replicon)，继而通过转 ， 化或转染宿主细胞， 化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子 细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 分子。 细胞，再进行扩增提取获得大量同一 分子 也称基因克隆 重组DNA 基因克隆或 也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)
质粒DNA的小量 快速提取
第五次实验 质粒DNA的小量快速提 取制备 目的：为了证实所得的转化子的重组质粒DNA是否 目的：为了证实所得的转化子的重组质粒DNA是否 DNA
确实由载体质粒与目的基因组成， 确实由载体质粒与目的基因组成，已排除其它可能 方式的连接。 方式的连接。 常用鉴定方法：小规模制备质粒DNA进行限制酶切 常用鉴定方法：小规模制备质粒DNA进行限制酶切 DNA 分析； 互补；插入失活；杂交筛选。 分析；α互补；插入失活；杂交筛选。 正常重组DNA：经酶切电泳，可获得5.4kb的载体和 正常重组DNA：经酶切电泳，可获得5.4kb的载体和 DNA 5.4kb 1.1kb的目的基因 的目的基因。 1.1kb的目的基因。 错误基因插入：不能酶切或片段大小不同。 错误基因插入：不能酶切或片段大小不同。 反向连接（出现在平端连接）：不被酶切或片段大 反向连接（出现在平端连接）：不被酶切或片段大 ）： 小不同。 小不同。
质粒DNA的微量提取SDS法
三.原理：
01
DNA 是具有一定结构的物质，特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有 机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。
02
SDS是一种阴离子表面活性剂，既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS 处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中 同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙 酸钾中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大， 难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心 管的底部。
260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度， OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA， 33g /ml单链。可根据在260nm以及在 280nm的读数的比值（OD260/OD280） 估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比 值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂 质的污染。
结果
1%的琼脂糖凝 胶，90V,40分 钟。
实验二 质粒DNA的微量提取 碱裂解法（SDS法）
BRAND PLANING
商业产品部
一.目的与要求
通过质粒的一些基本特性、质粒DNA的提取技术，学习用碱变 性法提取质粒DNA的方法。
二.相关知识
质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定 遗传的遗传因子。绝大多数是一种环状的双链DNA分子。
广泛存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。
细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb， 它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶 系。
质粒DNA的存在区域和结构特征 电镜中质粒DNA的形态
质粒DNA的提取（碱裂解法）
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
碱裂解法质粒提取
戚农解法捉取血粒利用的足共价闭合环状隨純DNA吋线状的染色体DNA片段的们卜学I:的雄井来分离它们.在P H ift介干12. 0-12. 5 这个狹窄的范国内・线状的DNAXX螺旋结构牌开变件・共价闭坏质粒DNA的做他如然断裂•但两条互补谨彼此依然相互盘绕而紧纟炮结介在一起.^WApHI.S的酣酸钾簡盐缓冲液便闭拜低后.其价闭介环状的历林DXA的两条互补琏迅速而准确地芟件.而线状的染色体DXA的两条互补谥彼此已龙全分开.不能迅速而准确地更性•它心绸绕形成网状结构.通过离心.染色体DNA9不稳定的大分子RNA、蛋白ffi-SDS更合物彎一起沉淀下来.而质桂DM知留在上淸液中.仪器、材料与试剂仪器：恒温堵养箱、恒SA晞床、小型岛速离心机、岛斥灭肃锅.材料：带有质枝的大肠杆菌试剂：Solution I□Cmaol / L 匍荀椭□rnnol/L 三疑甲基氮基甲烷(TMjTrx・HC1 (pHS. 0}1.0 so] /L 乙二胺四乙酸(EDTA) (pHS. 0)Solution II0. Inol/L NaOH. 2%SDS(十二烷雄晞酸钠).用前答体枳混合Solution III5rx>ol /L 钾 GO aL冰乙酸11.3mL水2S. 5mLTB级冲液lCmsol / L Tris • HC1laizol/L EDTAipHS. 0)WRNAttlRXAttA)W RXA fftitt于 1 Cmaol/L Tris -HCKpHT.S). IZol/LhCl 中.配成 10之/丄的浓度.干 KXTC 加热 15min.缓慢冷却至室船.保存于-20-C.实!脸步曝（采用SDS碱裂解法小駅別备脈林DMD1.大肠杆菌培养2.捉取帧粒3.质林的琼册輸凝胶电泳实鮒操作步曝I.将过夜培弊的2=1细繭.高速离心1分钟.彻，底去除上淸.2•加入lOCtnl solution I.用枪头或抿荡话充分悬浮细茵・3•加入200ml Solution IE立即上下颇倒或用手指弹管底・使细0B稷解.室温放立（2分钟左右）至藩液竇成蹄.4.加入lOCtnl Solution III.立即上下硕倒5-10次.便Z充分中和.室温放立2分钟.注总：步驟2和3在冰上探作效果更佳.5.岛速离心・15,000转/分钟.10分计.无篙低盘炭心.注世：捉岛离心速度・使沉徒更加紧密.步驟6操作取上淸更为方便.6.取出A1样&收集訝和35柱・在管壁标上样胡号.将步驟5中的上淸全部转移到似或倒入）3S柱里.盖上离心管盖子.室昭放 ?12分俳（室盘放近时间不业要.可长可短〉：用台兀离心机室盘冊連〈12・000转/分钟）烫心1分忡.注直转移上淸时不耍吸取沉淀.否则会出现Genoiric DNA和蛋F倾污染.离心管盖子缶上时・柱子内斥的增加・可能会使部分溶液从柱子底器漁出・为正曲现欽.7.取下3S柱.弃去掉收集管中的废液.将3S柱放入同一支收集管中•吸700ml W as h Solution到3S柱•离心1分钟.s. 步骤7 一衣.9.取下35柱・弃去惮收集管中的废液・将3S柱放入何一支收集管中.岛速离心2分钟.10.将3S柱放入干净的1・5ml的离心营中.在3S柱子股中央加SOMITE或水.不要盖上离心管陰室爲下放M 2分佻孟上离心仔盖. 室隘岛速离心1分钟.注童：将充戒水预想到50・C左右可以捉局洗脱效率.测用用历粒用30=1预羔的水洗脱.浓度•般满足测片:耍求.II.洗脱的页杭可以立即用于各种分子生物学操作或70'C保存备用.1』过夜焰养细胞•欣粒如果用50"水洗轧通常情况下可以取10nl洗脱液做Acaroze电泳戒酚切分析.实验二农杆情介导的Ifl物19传转化（练合设计实验〉<-）实验目的1.使芳生全而了解农杆繭介导的檢物转基因的方法：2.使学生根棚已学的知识.在教师描导下设计一个农杆菌介导Ifl物的遗传转化实0方案：3.使学生掌握农杆菌培养.檢初外IJU本无凿系建立・农HiStt染和转化体篩选零一系列试笛方祛.（二）焙养基1.LB培养基：每升含羊齐酵母段幵5 s，胰蛋白淼10匕.XaCl 5乙・PH 7.22.Y£B培养基：毎升含有：牛肉浸ff 3 s・醇母igff 1 S，蛋白腺5匕•岷椭5匕・耘S3 • H2O 0.5 c・PH 7.03.YEPffi^M：毎升含有：牛肉浸•膏10匕.酵毎捉取液10 s・NaCl 3 B . PH 7. 04・实生苗培1/2MS培养基.附加3O S和0.6%琼脂.PH二6.0・，3.预培养如 MST.0~l.2ms L 2・4・»0. 2m匕I 6・BA・3g奁椭+6匕琼盼.PH=5. S・6・分化培养基：XS*0. 2DB/L IAA*2. Cm C/L 6-BA-305能椭*6. 3C球耶+A品036叱 L・ PH=5. 8-7.稀选焙养基，分化焙养呈+A匕血3 G=c. L*5CCm C/L Cb^l0«. L Kan. PH=5. 8.（三）试验仪话超级趙海L作台智能气帳培菲箱大型落地式高速冷栋烫心机凝胶成像系统台式密温高速离心机立式灭菌锅电泳相关设备（四）农杆肃介导植初转化实崟步屋（以油菜子叶转化为例）1.根癌农杆18的焙养将保存于甘油中的菌种用划线法接种J LB固体平板培养基1：培养•每次转化前…天从平板I •挑取单甫落接种I-YEB液体垢养基中. 在269, 170r/min的摇床上过夜培养.鬥OD600{ft达0.3〜0・5时・将八在4000r/B in的条件下髙心弃去上淸・然后用液体MS 培弄基将兀竝込稀样5〜8倍待用.2 •建立无凿苗将抽菜种子用7MM浸泡30玄后，于©畑C12脩液中处理lOoin,无茵水冲洗3次后.樓种Fl/2MSffl体培养基上.在25±1£ 黒暗条件下焰养3d.后移至光下培养1〜3d.取梵下胚轴和带柄子叫接种在预堵养基上.在25'C・光P«®«为"001*・16h光照周期焙养条件下站养.待用.3.农ffffltt染在无菌条件下・将及培养X子叫和下胚轴收集于一个无创小饶杯中.没入于活化并/ 5-S倍的农杆《i液中.后转到无茵逑纸上.吸T哆余的荫液.接至共培养培养基中.在25X?生化培养箱中共培养2d.4・分化焙养将共站菲2d的受体材料先用无情水冲洗2〜3次至水泓淸后•用500=5 LCe£»泡30〜10辭n・材料IRiUMK于含脊无繭滩纸的培养■中干燥2d.将培养物转移至附加8-15«B/L卡那霉素和50（应孩节靑椭索（或头抱«＞的分化焙养基中.在250 蜃夜光周期为16 /ShtH定光照条件下培菲.3.那选培养将分化焰养中获得的绿芽移d筛选培养呈（卡那捺素浓嗖升致25«1）•每隔15-20dW接一次.注：I述方法步骤供学生设计实於方承时笏久学生可门己设计烟草的過传转化实聆方崇.。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备[摘要] 从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，因而被各实验室广泛采用。
[关键词] 质粒dna 碱裂解法快速提取（一）实验目的及原理从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的dna可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。
（二）试剂与器材1.器材：微量移液器、1.5ml离心管、各种移液器头、台式高速离心机、高压灭菌锅、冰块2.试剂：（1）溶液ⅰ：50mmol/l葡萄糖、10mmol/l edta，20mmol/l 25mmtris-hcl ph8.0。
（2）溶液ⅱ：0.4mol/l naoh（临用前用10mol/l naoh贮存液现用现稀解），2%sds sds（十二烷基硫酸纳）10％母液的配制。
（3）溶液ⅲ：60ml 5mol/l 醋酸钾，5ml冰醋酸，28.5ml h2o。
（4）te缓冲液：10mmol/l tris-hcl, 1mmol/l edta（ph8.0）。
（5）100%乙醇，70％乙醇。
（6）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液或30％的甘油。
（7）5×tris-硼酸（tbe）缓冲液。
（8）5×tris-乙酸（tae）缓冲液。
3.材料：（1）含puc系列质粒的大肠杆菌；（2）琼脂糖。
（三）实验步骤1.质粒dna的小量提取。
(1)取四支1.5ml离心管，编号为1、2、3、4。
用加样枪加各个溶液。
(2)分别吸取200μl培养液加入这四个离心管中，在离心机（12 000r/min）离心10min，弃上清液，收集菌体。
(3)在1、2、3号分别加入200μl溶液ⅰ，4号加入用等量蒸馏水代替，在快速混匀器上使菌体均匀悬浮。
(4)在1、2、4号加入200μl溶液ii，在3号加入（未加naoh，只加了sds）的溶液ii轻柔颠倒混匀。
碱裂解法小量提取质粒DNA
实验原理
• 酚/氯仿抽提
– 可以通过酚、氯仿抽提去除残留的蛋白质。酚和氯仿都 是蛋白质的变性剂，但酚的变性作用要远大于氯仿。 – 由于酚能溶解10%-15%的水，因此在使用前要用Tris溶 液饱和。以免减少抽提过程中DNA溶液的损失。 – 水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心 后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；氯仿 和酚可以互溶，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿 始终在下层，方便水相的回收。 – 由于酚与水有很大的互溶性，用酚/氯仿抽提后会有少量 的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制 性酶切反应），用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。
实验步骤
1.
2. 3. 4. 5. 6. 7.
取1.5ml过夜培养菌置于1.5ml离心管中，于微量 离心机上以12000rpm离心1min。 弃上清液。 重复步骤1、2 。 短暂离心后，尽量吸干上清液。 沉淀中加100μl溶液I，充分悬浮沉淀（用移液体 器吹打悬浮或剧烈振荡）。 加入200μl溶液 II(新鲜配置)，加盖后缓慢颠倒 离心管6次混匀（千万不要振荡），室温防置不 超过5 min 。 加入150μl预冷溶液III，缓慢颠倒6次混匀，置 于冰浴15 min 。
实验原理
• 乙醇沉淀DNA
– 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇， 在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。 – 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，乙醇可以 消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na离 子能与这些带电基团结合，在沉淀形成的部位降低多核苷酸 链之间的排斥作用，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。最 常用的盐是醋酸铵／氯化锂／氯化钠／醋酸钠。 – 沉淀体系如果盐浓度高，应在室温下沉淀。放到－20℃，时 间一长反而会导致大量盐的沉淀。 – 为了去除随DNA沉淀的盐，可用70%的乙醇洗涤沉淀。
快速小量提取质粒DNA的两种方法
)*+,-. /01020 345
’ #
图!
% " ! 2 F
快速提取法进行阳性克隆的快速检测
参考文献
/ # G@,H0IIJ K; ! L0-MANC 5;L;+O@.-AM-A 7;;OIPBNQP@0 RPI.-.S+8P@HI0@MI0T ,@.Q@P #.U BU+RIPU A10-.S C@HI0 P@HI0@MI0T 10BAA+’&:&; VQ0-I. E; 7;+ GNIW-BPU >; 9;;8 GCI0M+ G,@PPXGN@PB D0B1@0@M-I. IS DP@A,-U 6?8 W0I, 5; NIP- YA-.S Z0S@.-N GIP[B.M; LINQA ;/&&"\/2 )"=\//% ’ //"; % " ! 9B ]CQ,B-+3-Q ^-QTQ.;;8 OIU-W-BU OBMCIU WI0 _AIP@M-I. IW DP@A,-U 6?8+ E-IMBNC.IPIST /&&2+2 & / #( %F ’ %:;
连 &有 限 公 司
# 实验方法 $%" 碱 裂 解 法 ! & 挑 单 菌 落 接 种 于 !,M (U U5 培 养 基 N 含 相 应 抗 生 素 O 中 *$G $ 振 荡 培 养 过 夜 + " & 把 培 养 液 置 -V 管 中 *
取液!模拟海水及未注射的沼虾"色素颗粒均扩散 于 整个色素细胞# 而虾的复眼着生在眼柄末端"剪除眼 柄同时也剪除了具感光能力的复眼$ 这说明当沼虾在 失去感光能力后"由眼 柄 分 泌 的 色 素 调 节 物 质 只 具 有 单 向 调 节 功 能 "即 只 能 使 色 素 颗 粒 聚 集 于 色 素 细 胞 的 中央从而使沼虾的体色变浅%由于沼虾色素细胞种类 较多"调节机制也不尽相同"故通过此实验只能说 明 这 项 结 论 对 红 色 色 素 细 胞 成 立 &$ 综上所述 "沼虾的眼柄可以分泌使色 素 颗 粒 在 色 素细胞中聚集的物质$ 沼虾在接受光刺激后通过调节 此物质的分泌来调节体色的变化$ 此外"由于眼柄提 取液经过沸水浴处理后没有变性"所以眼柄分泌物应 为非蛋白物质$
DNA重组技术(Ⅰ) 小量快速提取质粒DNA方法
DNA重组技术(Ⅰ) 小量快速提取质粒DNA方法刘伟民【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】1991(1)2【摘要】质粒DNA的提取是最基础的DNA重组技术。
国内外已经发展了许多方法用于批量提取质粒DNA。
这些方法都可以获得满意的效果。
这里介绍两种小量快速提取质粒DNA的方法,可用于重组子筛选及酶切分析。
(一)碱裂解法 1.将过夜培养的菌液1.5ml转移到小离心管内,15.000r/min离心30sec,弃去上清,将离心管倒置尽量除去培养液。
2.将沉淀的菌体再悬于100ml冰冷的溶液A中(50mM 葡萄糖,25mM Tris pH8.0,10mM EDTA),不必要加入溶菌酶。
3.向A液中加入新配制的溶液B200μl(0.2N NaOH,1％SDS),迅速倒置几次,混合两溶液,放在冰浴上3—5分钟。
4.再加入150μl溶液C(5M醋酸钠60ml,冰醋酸11.5ml,蒸馏水28.5ml)混均后冰浴3～5分钟。
【总页数】1页(P46-46)【关键词】脱氧核糖核酸;重组技术;质粒DNA【作者】刘伟民【作者单位】黑龙江省科学院应用微生物研究所【正文语种】中文【中图分类】Q784【相关文献】1.小量提取质粒DNA的简易方法 [J], 郭晓丽2.一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法 [J], 何冬兰;余金龙;邵坤彦;邵洁云3.一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法 [J], 郭旭东;毛舒燕;侯冬霞;旭日干4.快速小量提取质粒DNA的两种方法 [J], 吴立柱;郑海洲;朱昀;霍晨敏;沈银柱;黄占景5.DNA重组技术(Ⅱ) 小量制备噬菌体DNA的方法 [J], 刘伟民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
质粒DNA提取方案(碱裂解法)
质粒提取原理采用碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA 与质粒DNA的变性与复性的差异不同而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开，DNA变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，留在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA及蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
Solution I：葡萄糖可增加溶液的年度，维持渗透压，防止染色体DNA受机械剪切作用而被降解，污染质粒DNA；溶菌酶（可省略）水解菌体细胞壁的化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，具有溶菌的作用。
当pH<8.0时，溶菌酶受到抑制；EDTA有两个作用：(1)螯合Mg2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解。
(2) EDTA的存在有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度环境；Tris-HCl作为缓冲溶液维持适当的浓度和pH值。
Solution II：NaOH，DNA在5.0<pH<9.0时时稳定的，但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而使DNA变性。
加Solution II后系统的pH高达12.6，线性染色体DNA和环型质粒DNA氢键均发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键只发生部分断裂，且其两条链不会发生完全分离，待pH调至中性闭合环型质粒DNA很快复性恢复原来的构型，而染色体DNA不能复性。
SDS 是阴离子表面活性剂，它有溶解膜蛋白破坏细胞膜，解聚细胞中核蛋白，能与蛋白质结合成为R-O-SO3-···R+-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但SDS能抑制RNase的作用，所以在以后提取中必须将其除干净。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SDS:十二烷基硫酸钠,用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸。经SDS 处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体 DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的
线性片段。
氨苄西林:（2S， 5R，6R)-3，3-二甲基-6-〔（R)-2-氨基-2-苯
EDTA：四乙酸二氨基乙烷（二氨基乙烷四乙酸），又叫托立龙、依 地酸。EDTA 是一种重要的络合剂。EDTA用途很广，可用作彩色感 光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添 加剂，血液抗凝剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂 的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶 性配合物。在这里主要作用是降低细胞膜的稳定性。
乙酰氨基〕-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.o]庚烷-2-甲酸三水
化合物，为半合成的广谱青霉素。本实验中，大肠埃希菌对其敏
感，通过与青霉素结合蛋白（PBPs）结合，干扰细菌细胞壁的合
成起到抗菌作用。
Tris-HCl：三（羟甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基
甲烷。在这里，Tris缓冲液主要是做核酸和蛋白质的溶剂。
37℃振摇过夜。
2.收集细菌 取1.5 ml菌液转入离心管中，10000 r/min
离心1 min，弃上清。 3.悬浮细菌 将细菌沉淀重悬于100 μ L用冰预冷的溶液一 中，剧烈振荡使细菌沉淀悬浮。
注意：细胞悬液必须悬浮均匀，无可见沉淀块，否则所提质
粒DNA的纯度及得率会大大降低。 溶液一的作用是分散细胞，并鳌合金属离子使能够破坏质粒 DNA的DNase失活。 4.碱液裂解 加200 μ L新配制的溶液二。轻缓颠倒离心管6~8 次，使管内内容物混匀，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置2min。 溶液二的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白 质在碱性条件下变性。
有问题？您说话
谢谢聆听
或3'U寡聚核苷酸。如 pG-pG-pC-pA-pG 被切割产生pG-pGpCp 和 A-pG。可以用来去除DNA制品中的污染RNA。
DNase：脱氧核糖核酸酶。是一种可以消化单链或双链DNA产生
单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。
二、实验原理
在含有SDS的碱性条件下，细菌细胞壁破裂，释放出来的染 色体DNA、质粒DNA和蛋白质等都发生变性。当加入酸性的醋 酸钾溶液将pH中和至中性时，质粒DNA为共价闭合环状结构， 很快复性并溶解在溶液中。而染色体DNA由于相对分子质量大 难以复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体 DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下 来而被除去;然后用酚/氯仿抽提进一步除去少量残留的蛋白质； 最后用乙醇沉淀获得质粒DNA。
TE缓冲液:TE是由Tris和EDTA配置而成的，呈弱碱性,主要用于溶解 DNA，能稳定储存DNA。
RNase A：是一种被详细研究和具有广泛应用的5'核酸内切酶。
RNase A 对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。RNase A
专一地催化RNA的核糖在C（胞嘧啶）和U（尿嘧啶）残基下一
个核苷酸的5'磷酸二酯键裂开，形成具有 2',3'-环磷酸衍生物3'C
5.中和与复性 加150μ L用冰预冷的溶液三。轻缓颠倒数次， 使溶液三在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中5 min。 溶液三的作用是使pH恢复中性，质粒DNA复性，而染色体
DNA与蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。
6.离心沉淀 用台式高速离心机12000 r/min 离心5 min，将
含有质粒DNA的上清转入另一离心管中。
但碱裂解法有操作简便、快速、得率高的优点。
五、思考题
1.溶液一，二，三的作用分别是什么？加溶液一、二、三时要注意哪 些问题?
溶液一的作用是分散细胞，并鳌合金属离子使能够破坏质粒DNA的
DNase失活。溶液一使用前需用冰预冷。
溶液二的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白质在碱
性条件下变性。溶液需要新鲜配制。
棕色瓶中4℃保存。
7.TE缓冲液（pH 8.0) 10mol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 1mmol/L EDTA 8.RNase A (10 mg/mL)。 9.70%乙醇、无水乙醇。
四、实验操作
1.细菌培养 将含有pQE30质粒的大肠埃希菌TG1 10中，
溶液三的作用是使pH恢复中性，质粒DNA复性，而染色体DNA与
蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。溶液三使用前需用冰预冷。
2.实验中加入酚-氯仿、无水乙醇、70%乙醇和RNaseA的作用分别 是什么？
酚——变性蛋白质；
氯仿——萃取溶液中的酚； 无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒DNA； 70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分； RNase A—— 对RNA有水解作用
7.酚/氯仿抽提除蛋白 加等体积酚-氯仿，剧烈振荡混匀，静
置3 min待其分层后，12000 r/min离心10 min，将上层液转入另
一离心管中。
8.乙醇沉淀质粒DNA 加入2倍体积的无水乙醇，振荡混合， 静置5min使质粒DNA形成沉淀。12000 r/min 离心10 min，收 集质粒DNA沉淀，弃上清液。 9.乙醇洗盐 质粒DNA沉淀里含有一定量的盐分需除去。加1 ml 70%乙醇，轻缓摇动数次，12000 r/min离心2 min。弃上清 液。
质粒DNA的小量快速提取 （碱裂解法）
S2517实验室 第三小组
2015年11月17日
目录 Content
一、实验目的
二、实验原理 三、实验器材与试剂 四、实验操作 五、思考题
一、实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。
注释：
质粒（plasmid）:大小在1kb～200kb之间，结构简单，大多是具 有双链闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多 细菌和酵母菌中。质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能共存在 同一个宿主细胞中。质粒可在细胞间传递，其在胞内的存在一般对 宿主细胞的代谢活动无影响。
三、实验器材与试剂
（一）器材
高压灭菌器，恒温摇床，高速离心机，微量可调试移液器，
1.5mL离心管等。 （二）试剂 1.LB液体培养基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g,NaCl 10 g,去离 子水950mL。待溶质完全溶解后，用NaOH调节pH至7.0，加入去离
子水至总体积1000mL，121℃，1.01×105 Pa高压蒸汽灭菌20min。
2.氨苄西林 100 mg/mL。
3.溶液一 50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 10mmol/L EDTA (pH 8.0)。 4.溶液二 （新鲜配制） 0.2mol/L NaOH , 1％ SDS。 5.溶液三 0.5mol/L醋酸钾60 mL , 冰醋酸11.5 mL ，H2O 28.5 mL。 6.酚/氯仿 将酚和氯仿等体积混合，用Tris-HCl平衡至pH 7.6 ， 置于
10.溶解质粒DNA 待残余乙醇挥发干净后，加30 μ L TE缓冲
液（pH 8.0）溶解沉淀，加2 μ L RNase A (10 mg/mL), 37℃保
温30min以去除RNA。所得质粒DNA置-20℃保存备用。
质粒DNA的还有以下几种提取方法：
煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等