水稻原生质体提取及转化
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十四、水稻原生质体提取及转化
1.将水稻种子去壳后，用70%酒精清洗30 sec，再用30% 次氯酸钠溶液浸泡30 min。
2.将消毒过的水稻种子植于1/2 MS培养基中，避光培养12-14天后，得到的黄化
苗可进行原生质体提取。
3.现配20 mL enzyme solution并置于5 公分塑料培养皿中。
4.取黄化苗水稻茎部用锋利刀片细切至0.1-0.5 mm置于enzyme solution中。
5.将含有水稻材料的enzyme solution 抽气15-20 cm-Hg，15-30 min。
6.28℃，40 rpm持续震荡3 hr。
7.28℃，80 rpm继续震荡30 min。
8.用300目尼龙网布过滤含有原生质体的enzyme solution，将过滤的enzyme
solution 250g离心3 min。
9.去除上清液，小心用W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。
10.再次用250g离心1 min。
11.去除上清液，加入W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。
12.原生质体置于冰上30 min后可进行PEG转化。
13.30 min 稍微离心去除上清液，加入MMg solution 使原生质体总数为2-5×105。
14.取5-10 μg Plasmid DNA 体积为20μL，加入200μL 原生质体，置于冰上10 min。
15.加入等体积PEG4000溶液，小心混匀并置于室温下15 min。
16.加入1 mL W5稀释并终止反应，100g离心2 min。
17.去除含有PEG4000的上清液，加入W5或Incubation Solution重新悬浮并置于用
0.1% BSA浸泡过的塑料培养皿中培养。
18.原生质体在28℃，40rpm 暗培养12-16 hr后用激光共聚焦显微镜观察。
试剂配方：
Enzyme solution
Cellulase RS (Yakult)2%
macerozyme R10 (Yakult)1%
MES pH5.60.1%
mannitol (fresh prepare)0.4 M
Heat 55℃,10 min and cool at RT
CaCl2.2H2O 0.1%
0.45 μm Filter sterilized
W5 Solution
Working Stock Add
154 mM NaCl 3 M 10.3 mL
125 mM CaCl2 1 M 25 mL
5 mM KCl 0.2 M 5 mL
2 mM MES (pH5.7) 0.1 M 4 mL
5 mM glucose 0.1 M 10 mL
Add H2O final to 20 mL
MMg Solution
Working Stock Add
0.4 M mannitol (fresh) 0.8 M 7.5 mL
15 mM MgCl2 1 M 0.15 mL
Add H2O final to 200 mL
PEG Solution (40%,V/V)
Stock Final concentration PEG 4000 (Fluka,81240) 4 g 40%
0.8 M mannitol 1.093 g 0.6 M
1 M CaCl
2 1 mL 0.1 M
Add H2O Final to 10 mL
将PEG solution 与55 ℃水浴溶解，冷却后可进行转化
Incubation Solution (10 mL)
Working Stock Add
0.6 M mannitol 0.8 M 7.5 mL
4 mM MES pH5.7 0.1 M 0.4 mL
4 mM KCl 0.2 M 0.2 mL
Add H2O 1.9 mL。