平痫冲剂对戊四唑致痫大鼠颞叶谷氨酸受体和γ氨基丁酸受体的阻碍

【摘要】目的探讨平痫冲剂抗癫痫的作用机制。

方式腹腔注射戊四唑制成慢性癫痫模型,通过免疫组织化学方式和显微图像分析技术检测大鼠颞叶的谷氨酸受体(nmdar1)和γ-氨基丁酸受体(gaba-arα1)免疫反映的阳性细胞数(n)、阳性细胞面积比(aa%)及阳性细胞积分吸光度(ia)。

结果关于nmdar1,模型组(b组)同正常对照组(a组)比较,颞叶nmdar1的n、aa%上升,阳性细胞积分吸光度(ia)增加(p<；而西药医治组(c组)、中药组(d组)与b组比较,颞叶的nmdar1的n、aa%都有不同程度的下降,ia也有不同程度的减少(p<,p<。

关于gaba-arα1,b组同a组比较,颞叶gaba-arα1的n、aa%下降,ia降低(p<；而c组、d组与b组比较,颞叶的gaba-arα1的n、aa%都有不同程度的增加,ia也有不同程度的升高(p<,p<。

结论平痫冲剂抗癫痫的作用机制可能是通过抑制颞叶兴奋性神
经递质受体nmdar1的活性与表达,并激活
其抑制性神经递质受体gaba-arα1的活性与表达,从而降低大脑皮质的兴奋性,有效抑制癫痫的形成及进展。

【关键词】癫痫；平
痫冲剂；戊四唑点燃型癫痫大鼠模型；受
体abstract：objective to explore the possible antiepileptic mechanism of pingxian powder. methods in the experiment, pentylenetetrazole (ptz) was injected into abdomen of rat to make epileptic kindling model. the total number, percentage of positive area and integral optical density of n-methyl-d-aspartate receptor1 (nmdar1) and γ-aminobutyric acid-a receptor (gaba-arα1) of immunoreactive cells in the temporal cortex were studied by the immunohistochemical method and image analyzing system. results the total number, percentage of positive area and integral optical density of nmdar1 of immunoreactive cells in the temporal cortex of model group were more than normal group (p<, while these numerical values of western and chinese medicine group decreased to varying degrees
compared with model group (p<, p<. the total number, percentage of positive area and integral optical density of gaba-arα1 of immunoreactive cells in the temporal cortex of model group were less than nomal group (p<, while these numerical values of western and chinese medicine group enhanced to varying degrees constrasting with model group (p<, p<. conclusions pingxian powder may reduce the excitability of cerebral cortices by inhibiting the activities of nmdar1 and promoting the activities of gaba-arα1 in the temporal cortex to inhibit the formation and development of epilepsy.
key words：epilepsy；pingxian powder；pentylenetetrazole (ptz) kindling epileptic rat model；receptor
癫痫是一种常见的慢性脑部疾病,全世界约有4千万人受累。

我国癫痫的患病率约
为‰～‰,其中儿童癫痫的发病率约为成人的10倍,且半数以上在10岁以内起病1。

该病严重影响患者的生活、工作、学习,且可能在发作时遭遇危险而危及生命,还会伴有一系列复杂的社会心理问题,给患者家庭及社会带来很大负担2。

因此,如何正确、有效地防治癫痫已成为医学界尤其是儿科界广泛关注的问题。

平痫冲剂经长期的临床运用,证明确有疗效。

本课题通过检测戊四唑致癫(ptz)大鼠颞叶氨基酸类神经递质受体的含量,探讨平痫冲剂对癫痫的治疗效果及作用机理,为临床治疗提供更科学更确切的理论依据。

1 实验材料药物与试剂
ptz用前以生理盐水配制成溶液,浓度为mg/ml；平痫冲剂(胆南星、白僵蚕、天麻、代赭石、石菖蒲、丹参、白芍等),用时煎煮浓缩；苯巴比妥浓度为mg/ml。

动物
60只28天龄的wister大鼠,体重
(70±10)g,雌雄各半,甘肃省实验动物研究中
心提供(医动字第14-007号)。

2 实验方法ptz点燃大鼠模型的制备
将实验大鼠适应性饲养4 d后,随机分为6组,分别为正常对照组(a组)、模型组(b 组)、西药治疗组(c组)及中药小、中、大剂量组(d、e、f组)。

除正常对照组外,其余5组均造模,参考文献3方法制备,即用ptz亚惊厥剂量32 mg/kg,用前以生理盐水配制成溶液,浓度为mg/ml,每日1次,腹腔注射,持续4周后停药1周,再用相同剂量的ptz测试。

凡显示连续5次?级以上惊厥的,则视为达到点燃标准,?～?级的痫性行为被视为充分点燃。

大鼠惊厥发作采用七点评分法为标准3：0级,没有行为上的发作；?级,节律性点头或头部颤搐；?级,阵挛性咀嚼；?级,头部颤搐加前肢阵挛性抽搐；?级,袋鼠姿势(上身直立)；?级,跌倒；?级,全身强直阵挛性惊厥。

另外,正常对照组给予相同剂量的生理盐水。

给药
造模成功1 d后,除正常对照组和模型组外,其余各组开始灌服药物。

平痫冲剂用时煎煮浓缩,灌胃剂量按人与大鼠体表面积比4,折算成大鼠等效剂量,每日按4 ml分别灌服平痫冲剂水溶液,浓度分别为、、g/ml；西药治疗组每日按4 ml灌服苯巴比妥(浓度为mg/ml)。

正常对照组和模型组灌服等体积的生理盐水。

每日灌胃1次,连续灌胃3周。

灌注与取材
取该6组大鼠在相同条件下用乙醚吸入麻醉,四肢固定在手术板上,开胸,暴露心脏,直视下将穿刺针经左心室刺入,并以止血钳固定,然后剪开右心耳,随即用4 ℃预冷的生理盐水250 ml快速灌注,再灌注含40 g/l多聚甲醛的mol/l磷酸盐缓冲液500 ml。

先灌注再改成滴注,调剂滴速,先快后慢,共滴注时刻为1 h,观看大鼠全身僵硬后,迅速开颅掏出完整大脑,去除脑干及小脑部份,将修整后的脑组织块置于上述滴注液内4 ℃留宿,再置于200 g/l蔗糖中12 h。

然后每一个大脑半球以背侧海马最大断面处切取3 mm厚的
组织,要求该组织必需含有大鼠颞叶组织,随后制成石蜡包块,再做冠状切片,厚度为4
μm。

免疫组化染色(sabc法)
石蜡切片常规脱蜡至水,再放入h2o2稀释液中室温10 min；滴加复合消化液8 min；再滴加5%bsa封闭液20 min；再以1∶100的比例用蒸馏水将一抗(注：一抗有两种,一种是nmdar1多克隆抗体；一种是gaba-arα1多克隆抗体)稀释后,滴加在切片组织上,然
后放在37 ℃的培育箱中孵育1 h；再滴加生物素化山羊抗兔igg,孵育20 min；再滴加试剂sabc,孵育20 min；dab显色；苏木素复染,盐酸酒精分化,自来水反蓝,梯度酒精脱水。

再用中性树胶封片,晾干即可。

图像分析及数据统计
对免疫组化反应切片进行图像分析。

所有切片放大倍数均为100,测量窗面积为171 814 μm2。

分别检测大鼠大脑颞叶皮质各层的免疫阳性反应细胞。

每部位取2个视野,测量同一视野的阳性细胞数(n)、阳性细胞积
分吸光度(ia)、阳性细胞面积比(aa%),并分别取其平均数进行统计学分析。

结果用spss for windows统计软件进行统计学处理。

作单因素方差分析,进行组间两两比较,实验数据以x±s表示,以α=为显著性水准。

3 结果(见表1、表2)表1 平痫冲剂对ptz致痫大鼠大脑颞叶皮质nmdar1免疫阳性反应细胞的影响(略)注：与a组比
较,*p<,**p<(下同)。

表2 平痫冲剂对ptz致痫大鼠大脑颞叶皮质gaba-arα1免疫阳性反应细胞的影响(略) 4 讨论
平痫冲剂选取胆南星、白僵蚕、天麻、代赭石、石菖蒲、丹参、白芍等为主要药物,以化痰活血、熄风定痫为根本大法,临床疗效颇为显著。

本课题选用ptz点燃致痫模型,被公认为是理想的癫痫动物模型,其致痫性增高具有永久的保留能力,并较好的模拟了人类癫痫的进行性发展和长期反复的自限
性发作形式。

其优点在于：制作方便,成功率高；不受麻醉剂和手术过程的影响,便于全面观察动物惊厥发作；所需仪器设备简单,容易
推广；不破坏局部脑组织的结构,不伴有神经元损伤、坏死5。

故有利于进一步开展脑组织各项指标的检测,尤其适用于癫痫脑组织形态学的观察。

且本课题选nmdar1和gaba-arα1为检测指标,因其是兴奋性和抑制性氨基酸类神经递质受体的代表,是研究癫痫的传统指标,故具有很好的研究价值。

本实验结果显示,平痫冲剂是通过抑制颞叶皮质兴奋性神经递质受体nmdar1的活性及其表达,并提高其抑制性神经递质受体gaba-arα1的活性与表达,从而提高癫痫发作阈值,降低大脑皮质的兴奋性,抑制癫痫的形成及发展来发挥抗癫痫的作用。

【参考文献】
1 汪受传.中医儿科学m.北京：中国中医药出版社,.
2 曾军,洪震.人群癫痫危险因素及社会心理因素病例对照研究j.中华流行病学杂志,2003,24(2)：116－118.
3 徐国龙,杨帆,章复清,等.柴胡加龙骨牡蛎汤对ptz点燃型癫痫大鼠脑内氨基酸含量的影响j.中国医药学报,2002,17(3)：165－167.
4 黄继汉,黄晓辉,陈志扬.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算j.中国临床药理学与治疗学,2004,9(9)：1069－1072.
5 李东培,才丽平,方秀斌.小豚鼠下呼吸道及内脏传入部位ngf表达的研究j.解剖学报,2002,33(4)：350－354.。